碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化修饰的影响

路晰媗,雷 红,徐 礼,梁海艳,周小莉,沙立萍

碘是人体必不可少的微量元素。碘原子是一种电子供体,作为还原剂发挥作用,可被特异性过氧化物酶如甲状腺过氧化物酶氧化,形成甲状腺激素(THs),对人体正常代谢和生长发育至关重要[1]。组蛋白甲基化修饰是表观遗传修饰的调节机制之一,近年来得到越来越多的关注。组蛋白不同氨基酸上的不同甲基化数目能够调控基因转录,并广泛参与细胞发育、凋亡、代谢、炎症反应及免疫应答等生物过程。组蛋白甲基化的形成主要依靠甲基化转移酶通过将甲基供体S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到其作用的组蛋白上来完成。在脊椎动物中,组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)特异性位于ORF的5′端,被认为是基因活化的标志,其形成需要经过H3K4甲基化转移酶的转甲基作用[2],混合谱系白血病(MLL)家族蛋白(MLL1-4,SET1A,SET1B)则是负责H3K4甲基化最主要的蛋白[3]。组蛋白3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)位于基因启动子区通常被认为是转录抑制的标志,可被赖氨酸特异性去甲基化(KDM)家族的KDM6B(又名含D3蛋白Jumonji结构,JJMJD3)和KDM6A作用发生去甲基化,引起基因转录激活[4]。既往有大量的研究探索了碘营养和甲状腺疾病的关系,但少有分析碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化的影响机制。本研究主要分析碘作用于人甲状腺细胞系后对H3K4me3和H3K27me3及相应甲基化转移酶的影响,从表观遗传学方面去探究碘影响甲状腺的潜在机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料:人正常甲状腺上皮细胞系N-thy-ori-3-1由中国医科大学内分泌研究所捐赠。细胞培养于含有10%胎牛血清(Gibco,美国),以及1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen,美国)中,置于37 ℃,5% CO2环境中培养,隔天换液,弃去上清液和未贴壁的死细胞,更换培养基,培养4～6 d,细胞贴壁70%～80%后将细胞接种于6孔板中,同时设定2个复孔,利用不同剂量(1 μM、10 μM、100 μM、1 mM、10 mM)的碘化钠(Sigma,美国)分别刺激甲状腺细胞6 h 和24 h。

1.2 Real time-PCR:细胞中加入Trizol溶液(Invitrogen,美国),根据试剂要求提取细胞RNA,检测RNA纯度和浓度,使用TAKARA反转录试剂盒按照说明在反转录仪器中进行反转录得到cDNA,在罗氏LightCycler 480 Real-Time PCR仪器中进行分析。2-ΔΔCt法进行相对定量分析,所有目的基因均以GAPDH为内参,最终定量=目的基因定量/GAPDH定量。引物序列如下,MLL 1上游序列为3’-GAGGACCCCGGATTAAACAT-5’,下游序列为3’-GGAGCAAGAGGTTCAGCATC-5’;MLL2上游序列为3’-AACCATATCGGCCTGGCATT-5’,下游序列为3’-CAGGCAGGTCAGCAGGTATC-5’;MLL3上游序列为3’-TGGTACTGACACTTCACAGGC-5’,下游序列为3’-ACCCGGTAGGACAAATACTGG-5’;MLL4上游序列为3’-AACCATATCGGCCTGGCATT-5’,下游序列为3’-CAGGCAGGTCAGCAGGTATC-5’;SET7/9上游序列为3’-GGCCGGTCCATTCAGCTCTCC-5’,下游序列为3’-GCAGGGCCAGGGCGTTTACA-5’; ASH1L上游序列为3’-AGTTTGCCCCCTTTAGCCTT-5’,下游序列为3’-CGATGAGAGTGCAGGGAAGT-5’;JMJD3上游序列为3’-GCAGGAATGCCAAGGTGAAAG-5’,下游序列为3’-GCAGCAGGACAGGTGAGAAGG-5’;GAPDH上游序列为3’-TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-5’,下游序列为3’-AGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-5’。

1.3 蛋白质印迹法(Western blot,WB):根据蛋白提取试剂盒(凯基,中国)步骤提取细胞蛋白。用100 μL裂解缓冲液将培养的细胞置于冰上裂解,用细胞刮板收集,进行涡旋震荡,于4 ℃、12 000 r/min离心10 min。收集上清液,利用蛋白定量试剂盒(碧云天,中国)进行蛋白定量。将定量蛋白煮沸,分别在6%和12%凝胶上进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将凝胶转移到聚乙烯膜上,(Millipore,美国),封闭2 h,用抗体anti-H3K4me3(Abcam,美国),anti-H3K27me3(Abcam)和 anti-β-actin(Abcam)在4 ℃下孵育,过夜,室温下与HRP标记的IgG抗体孵育2 h。采用化学发光底物(Thermo Fisher,美国)检测特异性条带。使用Image-Pro Plus对相关的免疫印迹条带进行定量分析。

2 结果

2.1 不同浓度碘刺激甲状腺细胞系N-thy-ori-3-1后细胞组蛋白H3K4me3的变化:甲状腺细胞H3K4me3蛋白水平随着高碘浓度增加而增加,在高浓度(100 μM、1 mM和10 mM)的碘化钠作用下H3K4me3整体蛋白水平显著升高。随着时间延长,在刺激24 h 后,甲状腺细胞H3K4me3整体蛋白的水平随着碘化钠的刺激逐渐下降,呈动态变化,见图1(封二)。

2.2 组蛋白H3K4me3甲基化转移酶在不同浓碘浓度刺激下的表达:碘化钠作用于甲状腺细胞6 h,使得细胞组蛋白甲基化转移酶MLL1和MLL2的mRNA水平显著升高,24 h后碘化钠仍能诱导 MLL1的转录表达增高,其他甲基化转移酶在碘化钠刺激下并无改变,见图2(封二)。

2.3 不同浓度碘刺激甲状腺细胞系N-thy-ori-3-1后细胞组蛋白H3K27me3的变化:随着碘化钠浓度的升高,H3K27me3总蛋白水平呈减少趋势,尤其是在1 mM和10 mM碘化钠刺激下,H3K27me3整体蛋白水平显著下降,随着时间延长至24 h后,H3K27me3整体蛋白水平较6 h 升高明显,但仍有随着碘浓度升高而下降的趋势,与6 h 的结果一致,见图3(封二)。

2.4 碘化钠促进甲状腺细胞高表达JMJD3:高浓度碘化钠(1 mM)能诱导甲状腺细胞JMJD3的转录水平增加,接下来的WB实验验证了JMJD3的蛋白表达在1 mM的碘化钠刺激下呈一致性升高,见图4(封二)。

3 讨论

本研究通过细胞实验探究了碘作用于甲状腺细胞引起的组蛋白甲基化及相关修饰酶的变化,发现浓度梯度碘作用于甲状腺细胞系后能够引起细胞整体H3K4me3蛋白量逐渐增加,而H3K27me3蛋白量则逐渐下降,同时H3K4me3转移酶MLL1,以及H3K27me3去甲基化转移酶JMJD3表达显著增加。

碘作为甲状腺激素合成最基础和最重要的元素,其与甲状腺疾病的发生有着紧密联系。机体内合适的碘营养状态对甲状腺的功能稳定尤为重要。碘不足和碘过量均可以导致甲状腺疾病的发生,如甲状腺肿、妊娠不良结局、甲状腺功能减退症、甲状腺功能亢进症及自身免疫性甲状腺炎等[5-7]。既往有大量流行病学研究发现高碘可能导致甲状腺自身免疫风险的增加。有研究提示[8],碘超足量地区和碘过量地区桥本甲状腺炎的累积发病率分别升高4.4倍和5.5倍。国外的研究显示实行食盐加碘政策后甲状腺自身抗体和桥本甲状腺炎患病率明显提高[9]。许多基础实验研究也证实了碘在桥本甲状腺炎中的重要作用。经典模型就是0.05%碘化钠饮水能诱导NOD.H-2h4小鼠发生自发性桥本甲状腺炎,而减少碘水喂养可减轻甲状腺炎的发生[10]。

碘过量引起甲状腺自身免疫的具体机制尚不完全明晰,在表观遗传研究方面更是稀缺。组蛋白甲基化是表观遗传修饰中非常重要的调控机制。组蛋白H3K4me3位于转录起始位点标志着基因转录活化,启动子区域H3K4me3的水平以及不同的分布宽度都和基因转录紧密相关[11]。甲状腺细胞作为自身免疫攻击的靶细胞,有研究报道其本身也能被碘诱导表达许多细胞因子和黏附分子,包括细胞间黏附分子1(ICAM-1),CC基序趋化因子配体2(CCL2),CXC基序趋化因子配体10(CXCL10)等[12-13],参与自身免疫性甲状腺炎的发生及发展中。研究发现桥本甲状腺炎患者甲状腺滤泡细胞CXCL8、CCL2和 ICAM1 基因启动子区域H3K4me3富集明显增加,并伴ICAM1、CCL2和CXCL8的表达显著增加,同时桥本甲状腺炎患者甲状腺组织高表达H3K4me3甲基化转移酶MLL1[14]。本研究结果提示碘能增加甲状腺细胞整体H3K4me3水平,同时能刺激甲状腺细胞MLL1转录表达增加,这一发现间接为进一步探究碘是否通过影响甲状腺细胞H3K4me3的改变而促使桥本甲状腺炎提供了表观学依据。

本研究的另外一个发现是碘也能影响H3K27me3的整体甲基化水平及JMJD3的表达。JMJD3通过转甲基作用特异性去除启动子区域H3K27me3的甲基从而解除对基因的转录抑制[15]。大量研究发现H3K27me3和JMJD3与自身免疫疾病相关,JMJD3在调控免疫中发挥重要的作用。在系统性硬化疾病的患者中,JMJD3在CD4+T细胞中呈明显的表达升高,同时相应伴有 H3K27me3显著下降[16]。在一项类风湿关节炎(RA)的研究中,半胱氨酸生成酶能减少RA患者关节成纤维细胞JMJD3 的表达,从而减少抑制白介素1β(IL-1β)诱导下的炎症因子表达。沉默JMJD3 基因或者用JMJD3特异性抑制剂干预则能调控基因启动子区H3K27me3的水平进而显著抑制IL-1β诱导下的成纤维细胞的炎症因子水平[17]。体内研究也表明抑制JMJD3能显著减缓胶原诱导小鼠关节炎模型的类风湿关节炎症状[17]。另一项研究发现JMJD3活性被抑制后能够减少前炎症因子IL-1β等刺激下的胰岛细胞表达趋化因子CCL2和炎症因子[18]。研究显示桥本甲状腺炎患者甲状腺组织高表达JMJD3,CCL2和CXCL10,利用肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导甲状腺炎模型后,发现JMJD3抑制剂能显著减少TNF-α诱导下的炎症因子CCL2和CXCL10的表达[19]。本研究发现高碘能诱导甲状腺细胞高表达JMJD3伴随H3K27me3整体蛋白的改变,为探讨碘对桥本甲状腺炎表观遗传影响提供了部分证据。但本研究仅探讨了甲状腺细胞整体甲基化的改变,缺乏对特定基因启动子组蛋白甲基化丰度的研究,未来仍需要通过免疫共沉淀测序等方法评估全基因启动子H3K4me3和H3K27me3的分布,更深入地分析碘对甲状腺细胞表观修饰的影响。

综上所述,本研究通过体外实验探讨了碘对甲状腺细胞的组蛋白甲基化影响,发现碘作用于甲状腺细胞使得细胞整体H3K4me3的表达增加和H3K27me3的表达减少,伴随MLL1和JMJD3的表达增加。这为进一步探讨高碘与甲状腺自身免疫的机制研究提供了表观学的研究基础和靶向治疗的新思路。