染色体G显带核型分析联合拷贝数变异测序技术在产前诊断中的应用

詹福寿,魏 波,宋旭梅,马一婧,芮淑贤,贾 伟

羊水细胞染色体核型分析目前仍是诊断胎儿染色体病的金标准,可检出低比例嵌合体、非整倍体、片段较大(常大于5 Mb)的染色体缺失、重复、倒位及易位等,而对于小于5 Mb的染色体微缺失、微重复片段则无法检出,并不能准确判断额外小标记染色体的来源[1-2]。单核苷酸多态性芯片技术(SNP-array)实验程序烦琐、成本较高、通量较低,这些限制了该技术在产前遗传学诊断中的大规模应用。拷贝数变异测序(CNV-seq)是一种低深度全基因组测序技术,可检出基因组内大于100 kb的基因拷贝数变异(CNVs),具备操作简便、检测范围广、报告周期短、费用较低、所需样本DNA量少(10 ng～50 ng DNA)、分辨率高、通量高等技术优势[3]。2019年专家共识提到可以考虑将CNV-seq检测作为一线的产前诊断技术应用于临床[4]。本研究主要探讨CNV-seq技术联合染色体G显带核型分析在胎儿染色体病产前诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取2020年10月至2022年6月在宁夏医科大学总医院产前中心就诊936例患者,平均年龄(32.56±5.18)岁,其中,年龄高风险(预产年龄≥35岁)157例(16.77%),年龄<35岁者779例(83.23%)。产前诊断时的孕周为16+2～32+6周,平均孕周(18.95±3.47)周。孕妇签署产前诊断知情同意书后穿刺,抽取羊水行CNV-seq技术和染色体G显带核型分析联合检测。

1.2 产前诊断指征:①年龄高风险(预产年龄≥35岁者)157例;②产前筛查高风险孕妇128例,包括早、中孕期血清学筛查(MSS)高风险和无创产前筛查(NIPT)高风险;③产前超声检查发现胎儿异常365例,其中超声异常包括颈项透明层(NT)增厚、颈项软组织(NF)增厚、羊水过多或过少、结构异常及多个超声软指标异常等;④胎儿宫内发育迟缓62例;⑤既往有不明原因的不良孕产史85例;⑥夫妇一方染色体异常者46例,包括染色体平衡易位携带者或非平衡染色体结构异常;⑦其他93例,包括夫妇一方有致畸因素接触史、孕期服药史、不良生活史、近亲婚配等。本研究通过宁夏医科大学总医院科研伦理委员会批准(第2020—689号),所有孕妇均签署产前诊断知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 超声引导下羊水标本采集:完善相关检验、检查,签署介入性产前诊断知情同意书,孕妇仰卧位,超声引导下采用21 G穿刺针行羊膜腔穿刺术,为避免母体细胞污染,穿刺成功后先抽取羊水1～2 mL丢弃,更换注射器后继续抽取羊水3管,每管约8～10 mL,其中2管用于细胞培养制备染色体,剩余1管提取DNA用于CNV-seq技术检测。

1.3.2 羊水细胞染色体G显带核型分析:2管羊水分2线独立操作,1线采用和能生物羊水细胞培养基(广州和能生物科技有限公司),另1线采用BI羊水细胞培养基(上海碧艾生物科技有限公司),分别置于两台含5% CO2的37 ℃培养箱独立培养。8～10 d后视细胞生长情况加入秋水仙素继续培养3～5 h,使用胰蛋白酶消化法收获细胞,滴片并于75 ℃烤片3 h 后G显带。制备好的玻片置于MetaSystems染色体全自动扫描分析系统(Ziess公司,德国)扫片分析,每线培养物计数不少于10个细胞,挑选不少于5个分散适中、带纹清晰、至少达到400条带水平的完整细胞进行核型分析。如疑为嵌合体或异常核型,则加大计数,一般不少于50个细胞。染色体的核型描述依据人类染色体国际命名体制(ISCN)ISCN 2016进行。

1.3.3 CNV-seq技术检测:常规抽提羊水基因组DNA,使用染色体CNV检测试剂盒(北京贝瑞和康生物技术有限公司生产)和Illumina测序平台NextSeq CN500对DNA文库进行测序,检测染色体非整倍体及全基因CNV,严格按照试剂说明书及实验室检验标准操作规程(SOP)进行操作。测序结果通过ChAS 2.0软件(Chromosome analysis Suite)进行数据分析,选取长度≥100 kb的片段进行分析。按照《美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)序列变异分类标准与指南2015》进行CNV致病性分析。主要参考人群多态性数据库DGV(the Database of Genomic Variant)、人类孟德尔遗传在线数据库OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、患者表型相关的基因组结构变异数据库DECIPHER(the Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensemble Resources)、基因剂量效应数据库ClinGen(Clinical Genome Resource)、基因变异数据库ClinVar及PubMed等数据库及文献进行CNV结果的判读。根据CNV的性质不同分为致病性CNVs(pathogenic variants,P)、可能致病CNVs(likely pathogenic variants,LP)、临床意义不明确CNVs(variants of unknown significance,VOUS)、良性CNVs(benign variants,B)及可能良性CNVs(likely benign variants,LB)5类[4]。为了临床遗传咨询的需要,本研究只对前3类CNVs进行分析[5]。对检测到VOUS的病例,建议进行胎儿父母CNV-seq检测验证。

1.4 统计学方法:采用SPSS 27.0统计软件,计数资料采用例数或率(%)表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测成功率:936例具备产前诊断指征并行羊膜腔穿刺的孕妇羊水标本,有1例血性羊水细胞培养至14 d,未见贴壁细胞生长,培养失败,其余均培养成功,检测成功率为99.89%(935/936)。CNV-seq技术检测成功率为100%(936/936)。

2.2 胎儿羊水染色体G显带核型分析结果:胎儿羊水染色体G显带核型分析检出异常74例,阳性检出率为7.91%(74/936)。染色体数目异常47例,阳性检出率为5.02%(47/936),其中21-三体27例,18-三体 3例,13-三体1例,Turner综合征7例,Klinefelter综合征3例,47,XXX综合征2例,47,XYY综合征1例,其他染色体数目异常3例。染色体结构异常26例,阳性检出率为2.78%(26/936),其中平衡易位14例,倒位6例,其他染色体结构异常6例。染色体数目异常合并结构异常1例,阳性检出率为0.11%(1/936)。染色体G显带异常核型分布情况及阳性率,见表1。

表1 胎儿羊水染色体G显带异常核型分布情况及阳性率

2.3 胎儿CNV-seq检测结果:CNV-seq检出染色体异常98例,阳性检出率为10.47%(98/936)。检出染色体数目异常46例,其中1例胎儿羊水染色体G显带核型为47,XN,+3[5]/46,XN[95],CNV-seq检测结果提示未见异常。另外,14例胎儿染色体平衡易位携带者(包括5例罗伯逊易位)和6例胎儿染色体倒位携带者,CNV-seq检测结果也提示未见异常。CNV-seq技术检出致病性CNVs 64例(其中21-三体27例,18-三体 3例,13-三体1例,9号染色体三体嵌合体1例,Turner综合征7例,Klinefelter综合征3例,47,XXX综合征2例,47,XYY综合征1例),可能致病CNVs 12例,临床意义不明确CNVs 22例。与传统的染色体G显带核型分析技术(7.91%)相比,阳性检出率提高了2.56个百分点。

2.4 胎儿羊水染色体G显带核型分析联合CNV-seq检测结果:胎儿羊水染色体G显带核型分析联合CNV-seq检出染色体异常118例,阳性检出率为12.61%(118/936)。胎儿羊水染色体G显带核型分析与CNV-seq检测技术对于染色体非整倍体的异常检出率一致。1例胎儿羊水染色体G显带核型为47,XN,+3[5]/46,XN[95],1例46,XN,add(11)(q25)[4]/46,XX[71]的低比例嵌合体,CNV-seq检测结果均提示未见异常。1例47,XN,+9[11]/46,XN[39],CNV-seq结果提示9号染色体三体15%嵌合。对于羊水染色体G显带核型分析检出的7例不平衡性改变,CNV-seq检测结果提示异常并能准确地检出染色体异常的位置及片段大小。羊水染色体G显带核型分析结果正常,CNV-seq检测结果提示异常45例。羊水染色体G显带核型分析提示异常,CNV-seq检测结果提示未见异常21例。两种方法均检测到异常的53例。CNV-seq部分致病性CNVs检出信息表,见表2。

表2 CNV-seq部分致病性CNVs检出信息表

2.5 胎儿羊水染色体G显带核型分析、CNV-seq两者单独检测与其联合检测染色体异常检出率比较:胎儿羊水染色体G显带核型分析、CNV-seq二者单独检测对染色体异常检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CNV-seq单独检测与其联合染色体核型分析检测对染色体异常检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。羊水染色体G显带核型分析单独检测与其联合CNV-seq检测对染色体异常检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。羊水染色体G显带核型分析、CNV-seq二者单独检测与其联合检测对染色体异常检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 染色体G显带核型分析、CNV-seq两者单独检测与其联合检测染色体异常检出率比较

3 讨论

染色体异常包括染色体数目异常和结构异常,是导致胚胎停育、复发性流产及新生儿围产期死亡的主要原因。产前诊断是减少遗传病患儿出生的有效手段之一,是遗传病预防的重要环节。传统的细胞遗传染色体G显带核型分析仍是产前诊断染色体异常的金标准,但其无法检测出染色体亚显微结构改变,即染色体的微缺失和微重复综合征(MMS)。到目前为止,已明确由拷贝数变异导致的MMS已达三百余种,其发病率约为1/600[6-7],占染色体异常所致出生缺陷的50%[8]。相关研究表明,染色体G显带核型分析未见异常但产前超声提示结构异常的胎儿中,有6%～7%存在致病性或可能致病性的CNVs[9-11]。

张素华等[12]对316例孕妇羊水样本进行染色体G显带核型分析和CNV-seq检测,染色体G显带核型分析阳性检出率为7.59%(24/316),CNV-seq技术对致病或可能致病性染色体异常的检出率为9.49%(30/316),与传统细胞遗传学技术相比,染色体异常检出率提高了1.90个百分点。本研究对具备产前诊断指征且无羊膜腔穿刺手术禁忌证的936例孕妇胎儿羊水标本行CNV-seq技术和染色体G显带核型分析联合检测,除1例血性羊水培养失败外,其余均检测成功。染色体G显带核型分析检出异常74例,阳性检出率为7.91%(74/936)。CNV-seq技术检出染色体异常98例,阳性检出率为10.47%(98/936)。与传统的染色体G显带核型分析技术(7.91%)相比,阳性检出率提高了2.56个百分点。胎儿羊水染色体G显带核型分析联合CNV-seq检出染色体异常118例,阳性检出率为12.61%(118/936)。与仅CNV-seq技术(10.47%)相比,阳性检出率提高了2.14个百分点,与其他研究报道结果相似[5]。对于羊水染色体G显带核型分析检出的7例不平衡性改变,CNV-seq检测结果提示异常并能准确地检出染色体异常的位置及片段大小。羊水染色体G显带核型分析结果正常,CNV-seq检测结果提示异常45例。羊水染色体G显带核型分析提示异常,CNV-seq检测结果提示未见异常21例。本研究表明,对于胎儿非整倍体染色体异常,上述两种检测方法均能准确诊断,并且对于染色体核型分析无法判断染色体来源的异常片段,CNV-seq技术能够精确地进行定位。CNV-seq技术不能检出染色体的平衡易位、插入及倒位等[13],也不能检出低比例的嵌合体,但是这些在表型异常的人群中是相对罕见的(占比<1%)[14]。如本研究中的1号孕妇胎儿染色体核型为47,XN,+mar,但染色体核型分析不能准确辨认其来源,CNV-seq检测提示为13号染色体q11q12.12存在5.18 Mb的重复,致病性CNVs,为产前遗传咨询及胎儿的去留提供有力的科学依据。

嵌合体是指由来自不同基因型的合子演变而来的两个或多个不同的细胞系混合构成的个体。嵌合体的形成机制较为复杂,存在真性和假性嵌合体两种,因产前获取的胎儿相关表型有限,所以给产前遗传咨询带来了较大的挑战和难度。染色体G显带核型分析不能区分真性和假性嵌合体,因此有研究认为,核型分析提示嵌合体的个体应使用其他检测技术进一步印证[15]。在本研究中,1例胎儿羊水染色体G显带核型为47,XN,+3[5]/46,XN[95],1例46,XN,add(11)(q25)[4]/46,XX[71]的低比例嵌合体,CNV-seq检测结果均提示未见异常。有研究报道1例染色体G显带核型分析结果为2号染色体三体嵌合体,嵌合比例为9%,而CNV-seq技术检测嵌合比例高达33%,因超声随访发现胎儿多发畸形而引产[16]。近年来,随着分子生物学技术的快速发展,越来越多的临床医师把染色体G显带核型分析联合CNV-seq技术作为产前诊断的有效策略,CNV-seq技术可对未培养的原始细胞进行检测,且检测范围广,报告周期短,分辨率高,通量高,有效弥补了细胞遗传检测技术的不足,两种方法联合检测,可明显提高染色体嵌合体检测的灵敏度和准确度[17]。

综上所述,染色体G显带核型分析和CNV-seq技术各具优势,检测结果之间相互印证。染色体G显带核型分析在低比例嵌合体、平衡易位及倒位携带者检测方面更具优势,而CNV-seq技术可检出染色体的微缺失、微重复综合征,可弥补染色体G显带核型分析分辨率的不足。CNV-seq技术和染色体G显带核型分析技术联合应用,可提高染色体异常的检出率,降低漏诊率,有效提高产前诊断的质量,进一步降低人口出生缺陷的发生率。