大秦艽汤治疗类风湿关节炎:可能的分子机制和生物研究

郑若男,齐笑笑,李建辉,吕雪姣,姜 颖

(黑龙江中医药大学 基础医学院, 哈尔滨 150040)

类风湿性关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病,主要具有侵袭性,多发性和慢性性质[1-2].全球RA的患病率为0.5%～1%,女性患该病的几率约是男性的4倍[3].RA的主要病理表现是滑膜慢性炎症,血管混浊的形成,关节软骨损伤,韧带和肌腱的持续炎症,导致关节畸形和功能丧失[4-5].这些并发症可能伴有全身症状,如体重减轻,体温过低和疲劳[6].目前RA的发病机制并不明确,多种药物联合使用治疗,但有些药物治疗效果有限且有很大的不良反应.

大秦艽汤,出自刘完素的《素问病机气宜保命集·中风论第十》[7],在现代实验研究及临床中,涌现出诸多古方新用的情况,其中大秦艽汤作为古代中风-中经络之代表方剂,因具有清热补虚、祛风通络、除湿等诸多功效,可广泛用于很多疾病[8].

1 材料与方法

1.1 大秦艽汤中药物活性成分的筛选

大秦艽汤是由黄芩,独活,羌活,秦艽,甘草,防风,白芍,熟地黄,生地黄,白芷,白术,川芎,当归,石膏,茯苓,细辛十六位中药组成.以汉语拼音或拉丁词大秦艽汤为检索词,在中医药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中检索大秦艽汤的化学成分,并根据药代动力学(ADME)进行筛选:类药性质(DL)≥0.18,口服生物利用度(OB)≥30%. 因此得到大秦艽汤的有效成分和相应的靶蛋白,最终通过Uniprot数据库对靶基因名称进行了标准化.Uniprot数据库也被用来标准化目标基因名称.

1.2 活性成分靶点的预测及药物-疾病靶点

使用“类风湿性关节炎”作为检索词,从基因卡(Gene Cards)(https://www.genecards.org/)、基因疾病关联数据库(DisGeNET)(https://www.disgenet.org/)、药物银行(Drug Bank)(https://www.drugbank.com/)和人类在线孟德尔遗传(OMIM)(http://omim.org/)中检索RA相关靶点.将其靶点通过UniProt数据库转换为相应标准的蛋白质基因名称(https://www.uniprot.org/).整理药物和疾病的靶基因名,排除无法对应靶蛋白和重复项的基因名,从而获得结果为药物大秦艽汤和疾病类风湿关节炎活性成分的靶点.

1.3 药物-疾病共同靶点蛋白

将获得的大秦艽汤和RA靶标基因名称上传到在线网址Venny(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),大秦艽汤和类风湿关节炎的交叉靶点.

1.4 药物-活性成分-疾病-作用靶点网络图

构建大秦艽汤活性成分及治疗RA的潜在作用靶点相互作用关系的文档,并导入到Cytoscape 3.9.1软件中,得到药物-活性成分-疾病-作用靶点网络图.

1.5 蛋白-蛋白相互作用网络构建与关键靶点筛选

1)所选靶点被添加到STRING 11.0数据库可在(https://string-db.org )获得以创建PPI网络,使用“智人”作为物种,“最高置信度>7.0”作为最小相互作用阈值.2)Cytoscape软件用于可视化这些网络.3)利用CytoHubba插件以Degree值为指标进行排序筛选,得到互作性前8强的蛋白,即是大秦艽汤治疗RA的关键靶点.4)取其最强8个蛋白,用Cytoscape 3.9.1软件绘画成蛋白相互作用图.

1.6 GO 和 KEGG 富集分析

GO功能与KEGG通路富集分析,利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/,Version6.8)进行,GO分析预测了各种生物过程,细胞成分和分子功能.KEGG通路富集分析主要信号通路,P<0.05代表富集结果显著.通过在线软件,进行GO功能富集和KEGG通路富集分析,结果以气泡图或条形图来表示.

1.7 分子对接

分子对接用于验证活性成分与关键靶点之间的结合活性.AutoDockVina(Vina,版本1.1.2)是一个采用半柔性对接方法运行的程序,对接精度高达78%,被用来作为本研究的分子对接程序.从RCSB数据库下载PDBID分别为3o0i、4zzn、2zoq和5ax3的HSP90AA1、MAPK1、MAPK3和STAT3蛋白.将4个蛋白分别与小分子阿魏酸甲酯、豆甾醇和山奈酚进行对接.将小分子指定为配体,将蛋白指定为受体.受体经Pymol处理以去除水分子、小分子配体和氢化,然后使用AutoDock Tools 5.6.6转换配体形式并鉴定相应的活性口袋(Grid Box).最后,使用AutodockVina软件进行分子对接.通过Vina对接后,计算小分子与蛋白两两组合最低结合能的分数,并使用Pymol和Discovery Studio软件进行三维和二维角度的作用力分析和可视化.

2 实验结果

2.1 大秦艽汤筛选活性成分结果通过

通过TCMSP数据库、化源网、UniProt、SwissTargetPrediction以及文献检索,整理数据(除检索无有效成分靶点的活性成分),并进行筛选,以药物代谢动力学(ADME)为参数,类药性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%,生石膏在数据库以及文献检索中均无有效活性成分和靶点的记录,最终通过数据库得到其有效成分,秦艽、羌活、独活、防风、白术、甘草、黄芩、白芍、川芎、熟地黄、生地黄、当归、白芷、石膏、茯苓、细辛十六位中药的有效成分分别为:10个、15个、9个、18个、7个、98个、36个、13个、7个、2个、9个、2个、22个、1个、15个、8个,因此统计出有效成分为272个.再通过TCMSP获得大秦艽汤中活性成分的有效靶点为408个.部分活性成分信息见表1.

表1 大秦艽汤部分活性成分基本信息

2.2 大秦艽汤治疗RA潜在靶点预测结果通过

以“rheumatoid arthritis”为关键词检索RA的疾病靶点,利用OMIM、GeneCards、DisGeNET以及DrugBank数据库,去重后共有5 875个有效靶点.收集其药物和疾病有效靶点进行注释,通过韦恩图(图1)结果得出,将408个药物有效靶点和5 875个RA疾病靶点进行匹配,获得301个交集靶点.其交集靶点是大秦艽汤治疗RA的潜在靶点.图中右侧方框中展示部分交集靶点的名称.

图1 大秦艽汤与类风湿关节炎疾病交集靶点venn图

2.3 “大秦艽汤活性成分-交集靶点”网络图

通过2.2节得到交集靶点,筛选大秦艽汤的活性成分,删除不含共同靶点的活性成分,获得作用于类风湿关节炎的相关活性成分30个.归纳出大秦艽汤治疗类风湿关节炎的作用靶点、活性成分以及对应的中药,利用Cytoscape 3.9.1软件得出“大秦艽汤活性成分-交集靶点”的网络构建(图2).左侧上方三角紫色形状代表桃红四物汤的共同活性成分,其中细辛、白芍、甘草共有MOL000422,白芍、熟地黄、羌活、防风、秦艽、川芎、黄芩、甘草共有MOL000359,白芍、羌活、防风、秦艽、当归、独活、白芷、黄芩共有MOL000358,MOL001941羌活、防风、独活、白芷,MOL001942羌活、防风、白芷、独活, MOL002644羌活、防风、白芷, MOL001494防风、川芎、白芷, MOL000449熟地黄、当归、白芷、黄芩、生地黄, MOL004792羌活、独活, MOL001956羌活、白芷, MOL003588防风、白芷, MOL007514防风、白芷,MOL000173防风、黄芩,MOL000211白芍、甘草 ,左侧下方八边形橙色形状代表多个组方的化学成分;右侧方块代表大秦艽汤与类风湿关节炎交集有效靶点,连线代表活性成分与靶点间的相互作用,节点越大代表与之相关的药物成分越多.从药物活性成分分析,有MOL006212阿魏酸甲酯、MOL000449豆甾醇、MOL000422山奈酚、MOL000173渭黄花素、MOL001987β- 谷甾醇;从药物靶点角度分析,靶点与药物成分发生相互作用较多,有PTGS2、PTGS1、ADRB2、NOS2、AR、HSP90AB1、DPP4、SCN5A、ESR1.

图2 大秦艽汤活性成分-交集靶点

2.4 构建“药物成分-靶点”网络

将2.2节得到的交集靶点上传至STRING数据库,筛选获得大秦艽汤治疗RA的核心靶点蛋白,见图3,并将所得潜在目标靶点导入Cytoscape 3. 9. 1软件制作PPI 网络图,颜色由深到浅,颜色越深、节点越大表示节点越重要,见图4.得到301个关键靶点(节点代表靶点),1 246条边(边代表靶点间相互作用),平均节点值8.28.节点的大小与Degree数值呈正相关,数值越大, 节点越大.度值排名前20位的有STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、PIK3R1、FOS、TNF、EGFR、ESR1、IL6、MAPK8、MYC、MAPK14、RXRA、STAT1、CAV1、VEGFA,表明这些靶点在大秦艽汤治疗RA中有重要作用,见图5,前8核心靶点蛋白互作图(Degree≥80).见图6.

图3 大秦艽汤治疗RA的核心靶点蛋白

图4 PPI共同核心靶点网络图

图5 前20 degree核心靶点柱状图

图6 前8核心靶点蛋白互作图

2.5 GO功能富集与通路富集分析

通过Daviod数据平台以P值作为筛选条件,进行富集分析对大秦艽汤治疗类风湿关节炎的301个共有靶点,GO富集分析分别选取分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cell composition,CC)的前10条通路进行展示(见图7).根据富集分析结果,GO条目共为1 462个,BP条目1 098个:主要涉及对药物的反应、基因表达的正向调节、对外源性刺激的反应、对脂多糖的反应、对缺氧的反应、炎症反应、变老、细胞增殖的正向调节等;CC条目119个,主要涉及细胞外区,突触前膜的组成部分,细胞外间隙,胞质溶胶,膜筏,大分子复合物,内质网膜,线粒体等;MF条目245个:主要涉及酶结合,相同蛋白结合,蛋白结合,蛋白激酶结合,类固醇结合,血红素结合,转录因子结合等.

图7 以P值作为筛选条件共同靶点GO功能富集分析

2.6 KEGG富集通路分析

以lgP值为标准,从小到大排序,选取富集最显著的前20条通路.由图5可知,大秦艽汤与类风湿关节炎的301个共有靶点主要富集在脂质、动脉粥样硬化、胆固醇代谢、癌症、和AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路等等(见图8).

注:右侧 水平坐标表示以对数为 10 的 P值,垂直坐标表示路径名称;颜色代表丰富意义,颜色越深,丰富度越高

2.7 分子对接结果通过

通过分子对接术对筛选出的度值较高的成分及靶点进行活性成分对接,根据网络药理学分析结果,筛选出阿魏酸甲酯、豆甾醇、山奈酚等小分子配体(Degree>40),STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1等大分子受体.最低结合能越低结合能力越强,最低结合能是评价成分与靶点结合能力的一项重要指标.分子对接的结果显示,最低结合能最差的是-6.1 kJ/mol,平均最低结合能是-7.4 kJ/mol,最稳定的是山奈酚与HSP90AA1最低结合能是-9.4 kJ/mol,配体小分子山奈酚可通过2条分别为4.48Å和4.79Å的疏水作用力均结合至受体蛋白HSP90AA1的107号LEU氨基酸残基中,通过2条分别为3.97Å和4.09Å的疏水作用力均结合至受体蛋白HSP90AA1的138号PHE氨基酸残基中,通过2条分别为7.87Å的疏水作用力和2.89Å的碳氢键分别结合至受体蛋白HSP90AA1的162号TRP氨基酸残基和52号SER氨基酸残基中.通常,如果配体与靶蛋白的结合能小于0,则配体和受体蛋白可以自发结合,如果结合能<-20.934 J/mol,表明活性成分与靶点具有较强的亲和活性,因此,小分子阿魏酸甲酯、豆甾醇和山奈酚与目标蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3和STAT3之间均结合稳定.以上数据可以看出大秦艽汤活性成分与蛋白质之间有较强烈的结合关系,也说明大秦艽汤对类风湿关节炎具有直接的治疗效果.靶点与配体结合图(见表2),部分药物活性成分与核心靶点示意图(见图9).

注:在三维图中,绿色虚线表示氢键,淡绿色虚线表示碳氢键,粉色和棕色虚线表示疏水作用力.

表2 大秦艽汤核心成分与核心治疗靶点的结合情况

3 讨 论

网络药理学是探索疾病和药物复杂机制的智能策略[9].分子对接是一种基于结构计算机建模的方法[10].近年来被广泛用于中药有效成分和作用机制的预测,为中药新药的开发提供了有力的辅助[11-13].因此,本文通过网络药理结合分子对接探索大秦艽汤治疗RA的机制.

通过网络药理学研究得出,大秦艽汤共有272个有效化学组分,对应靶点共408个,大秦艽汤与类风湿关节炎的交集靶点共301个.关键的化学组分包括:阿魏酸甲酯、豆甾醇、山奈酚、渭黄花素、β- 谷甾醇等.大秦艽汤治疗类风湿关节炎的核心靶点为STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、PIK3R1、FOS、TNF等.

阿魏酸甲酯即4-羟基-3-甲氧基肉桂酸甲酯,是阿魏酸的衍生物,具有抗氧化、抗菌、抗炎活性[14-15].豆甾醇和β- 谷甾醇都为植物甾醇,植物甾醇是一类在植物中广泛存在的、具有环戊烷多氢菲骨架的甾体类化合物,是植物细胞膜的重要组成部分[16].有研究表明,β- 谷甾醇可以降低急性肺损伤大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平,提高抑炎因子IL-4和IL-10水平,降低炎症反应[17].研究发现,豆甾醇作为犀牛的活性成分,可抑制RA的破骨细胞分化、炎症反应和组织病理损伤,并下调NFKB1、NCF4和NCF1的表达.豆甾醇的活性成分,肉豆甾醇有利于改善类风湿性关节炎的关节损伤[18].山奈酚(kaempferol, KAE)是一种生物类黄酮,具有抗炎、抗癌、抗微生物、抗糖尿病等多种功能[19].山奈酚可抑制RA-FLS迁移,调节AKT1、P-AKT1、JUN、P-JUN、CASP3、TNFR1和TNFR2蛋白的表达.用山奈酚干预后,IL-6和TNF-α的浓度降低[20].

通过GO生物功能的分析,大秦艽汤主要通过对炎症反应、脂多糖的反应、对缺氧的反应、细胞增殖的正向调节等多个生物过程,达到治疗类风湿关节炎的作用.通过KEGG通路富集分析得出:大秦艽汤主要通过调控脂质、胆固醇代谢、癌症和动脉粥样硬化和AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路等来治疗类风湿关节炎.结合GO生物功能和KEGG通路富集分析,大秦艽汤治疗类风湿关节炎主要有:1)抗炎,在RA细胞因子相互作用中,介导炎症反应的重要成分有IL-6、TNF-α、IL-1、IL-2等炎性细胞因子,可诱导其他炎症细胞因子的释放,从而介导滑膜炎症及软骨破坏,因此抑制滑膜组织的炎症反应是治疗RA的关键[21].2)抑制脂多糖,脂多糖(LPS)是一种炎症调节因子[22].LPS作为革兰氏阴性细菌的外膜多糖,可以通过与细胞表面TLR4受体结合来激活下游NF-κB和MAPK信号通路,从而刺激细胞产生炎性细胞因子,趋化因子和介质[23-24].3)高压氧治疗.①HIF-1α的表达与VEGF的表达呈正相关,增加HIF-1α加速滑膜血管生成并导致关节炎症[25-26].②在缺氧条件下,RA中的成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLSs)转化为上皮间充质,HIF-1α通过STAT3 / HIF-1α/ fascin-1轴促进细胞的迁移和侵袭[27-28].③NF-κB与HIF-1α相互作用,促进基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9的酶活性,进而破坏组织学屏障,破坏骨物质[29].④在RASF中,HIF-1α过表达诱导Th1和Th17细胞扩增并增加INF-γ和IL-17的表达[30-31].⑤HIF-1α抑制剂吡啶甲酰胺化合物AMSP-30m促进滑膜细胞凋亡[32].

从分子对接结果分析,大秦艽汤有3个活性成分阿魏酸甲酯、豆甾醇和山奈酚和4个蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3和STAT3,最稳定的是山奈酚与HSP90AA1,热休克蛋白90α家族A类成员1(HSP90AA1)HSP90AA1可参与调节自噬,促进Pg-LPS诱导HGF产生炎症损伤[33].MAPK1和MAPK3是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员,MAPK主要涉及炎症和癌症类疾病.目前,关于RA和MAPK较为充分的研究,MAPK不仅在关节组织中能对促炎细胞因子的产生进行调节,而且在IL-17、IL-1和TNF-α受体下游的信号级联中起着重要作用[34].STAT3是STATs家族的成员之一.在细胞因子和生长因子等配体的刺激下,上游激酶激活STAT3(Tyr705或Ser727位点的磷酸化),磷酸化STAT3形成二聚体后进入到细胞核中,介导相应基因如抗凋亡基因Bcl-xL、Mcl-1及细胞周期调节基因c-myc、cyclinD1和促血管生成基因等表达的调控[35-36].作为神经炎性反应的正向调节因子-STAT3介导的信号传导通路能够激活小胶质细胞,调节多种特异炎性基因如IL-1β、IL-6和TNF-α等的转录和表达[37].通过与酪氨酸激酶(tyrosine kinas,JAK)组成 JAK/STAT 信号通路,参与细胞内的信号传导,调控肿瘤的炎症、增殖和侵袭[38].

4 结 语

本文利用网络药理学和动物实验进一步探讨了其在RA治疗中的作用机制.通过网络药理学和分子对接分析与预测的结果得出大秦艽汤药物的活性成分和核心靶点蛋白,明确知道大秦艽汤治疗类风湿关节炎主要通过抗炎、抑制脂多糖、高压氧治疗和抗细胞凋亡等多种治疗手段.从最低结合能得出最有的治疗途径,研究结果为大秦艽汤药物对治疗RA提供了重要的实验和临床理论基础.