外周血Foxp3、RANTES联合检测对原因不明复发性流产的临床诊断价值

陈艳青，张娟，吕霞明

(张家口市第一医院妇产科,张家口 075000)

自然流产的发生率为15%～25%,连续发生3次及以上自然流产即为复发性流产,也称习惯性流产[1]。导致复发性流产的原因多种多样,例如,夫妇或胚胎染色体异常、孕妇内分泌异常及子宫解剖结构异常等[2]。但是约有50%的孕妇复发性流产的原因不明确,临床上称为原因不明复发性流产,主流观点认为可能与母体免疫平衡失调和免疫耐受异常有关[3-4]。相关研究显示,叉头框蛋白p3(forkhead box protein p3,Foxp3)是与调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)发育相关的关键转录因子,在维持机体免疫耐受中发挥着重要作用[5-6]。T细胞正常表达和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted,RANTES)能够特异性趋化T细胞等多种免疫细胞,参与调节机体免疫[7]。目前已有研究表明,Foxp3及RANTES与复发性流产的发生有关,然而Foxp3与RANTES对原因不明复发性流产的诊断价值尚未报道[8-9]。因此,本研究通过检测原因不明复发性流产孕妇和正常妊娠孕妇血清Foxp3和RANTES表达水平,分析Foxp3和RANTES对原因不明复发性流产的诊断价值,为原因不明复发性流产的临床诊疗提供一定帮助。

资料与方法

一、研究对象

选择2021年7月至2022年9月本院收治的128例原因不明复发性流产患者为病例组。纳入标准:(1)符合《复发性流产诊治的专家共识》中原因不明复发性流产的诊断标准[10];(2)B超显示胚胎停止发育;(3)连续发生3次及以上自然流产;(4)年龄20～40岁;(5)患者及其配偶染色体正常;(6)内分泌正常。排除标准:(1)生殖器官解剖畸形;(2)孕妇存在吸毒、吸烟、酗酒等不良嗜好;(3)妊娠期间发生病毒感染;(4)伴有免疫功能缺陷;(5)妊娠期间精神状态严重异常;(6)重要脏器发生严重性疾病。

另选取同期于本院体检的128例健康妊娠者为对照组。纳入标准:(1)生育过健康足月胎儿;(2)无自然流产史、死产史。排除标准:(1)内分泌疾病、免疫系统缺陷、病毒感染;(2)重要脏器功能异常;(3)无上述不良嗜好;(4)距上次分娩<1年。

本研究经本院医学伦理委员会批准。

二、研究方法

1.外周血Foxp3和RANTES水平检测:抽取两组受检者空腹静脉血5 ml,取适量血液样品离心,保留上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Foxp3和RANTES水平。Foxp3 ELISA试剂盒(货号:F00843)购自上海西唐生物科技有限公司;RANTES ELISA试剂盒(货号:A096884)购自上海抚生实业有限公司。arioskan LUX多功能酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

2.免疫指标检测:取适量血液样品,抗凝处理后离心,分离外周单细胞并置于24孔细胞培养板中,加入胎牛血清、离子霉素、莫能菌素、佛波酯混匀,室温孵育4 h。加入FITC标记的抗人CD4抗体和抗人CD25各10 μl,混匀后避光室温孵育20 min,加入100 μl细胞固定液后再次孵育20 min。离心弃上清,加入破膜液100 μl,并加入抗人白细胞介素(IL)-17A和抗人Foxp3各10 μl。采用Attune CytPix成像型流式细胞仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)检测辅助性T细胞(Th17)和Treg百分比,并计算Th17/Treg。

3.资料收集:收集两组孕妇年龄、体质量指数(BMI)、孕周、孕次等基本资料。

三、统计学分析

结 果

一、病例组和对照组一般资料比较

病例组和对照组间年龄、BMI、孕周比较均无统计学差异(P>0.05),而孕次比较具有统计学差异(χ2=9.000,P<0.05)(表1)。

表1 病例组和对照组一般资料比较[(-±s),n(%)]

二、病例组和对照组外周血Foxp3和RANTES水平比较

经检验,与对照组比较,病例组外周血Foxp3[(98.55±13.67)ng/ml vs.(131.36±19.71)ng/ml]和RANTES[(179.28±25.72)ng/ml vs.(232.13±31.04)ng/ml]水平显著降低(t=15.475、14.833,P<0.05)。

三、病例组和对照组免疫指标比较

与对照组比较,病例组Th17比例和Th17/Treg显著升高(t=14.495、26.468,P<0.05),Treg比例显著降低(t=13.776,P<0.05)(图1、表2)。

图1 病例组和对照组Th17和Treg流式细胞图

表2 病例组和对照组免疫指标比较(-±s)

四、外周血Foxp3和RANTES水平与免疫指标和原因不明复发性流产的相关性

Pearson相关性分析结果显示,原因不明复发性流产患者外周血Foxp3水平与Th17、Th17/Treg呈显著负相关(r=-0.523、-0.476,P<0.05),与Treg呈显著正相关(r=0.517,P<0.05);RANTES水平也与Th17、Th17/Treg呈显著负相关(r=-0.469、-0.544,P<0.05),与Treg呈显著正相关(r=0.602,P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,外周血Foxp3和RANTES水平与原因不明复发性流产呈显著负相关(r=-0.539、-0.554,P<0.05)。

五、外周血Foxp3和RANTES水平对原因不明复发性流产的诊断价值

以Foxp3和RANTES水平为检验变量,以原因不明复发性流产的发生为因变量绘制ROC曲线,结果显示,血清Foxp3水平单独诊断原因不明复发性流产发生的AUC为0.820[95%CI(0.767,0.865)],其敏感度、特异度分别为70.31%、85.94%,最佳截断值为119.68 ng/ml;血清RANTES水平单独诊断原因不明复发性流产发生的AUC为0.840[95%CI(0.789,0.883)],其敏感度、特异度分别为69.53%、85.16%,最佳截断值为198.84 ng/ml;血清Foxp3和RANTES联合诊断原因不明复发性流产发生的AUC为0.909[95%CI(0.867,0.942)],其敏感度、特异度分别为86.72%、82.81%,两者联合诊断的AUC显著大于Foxp3单独诊断的AUC(Z=4.165,P=0.000)和RANTES单独诊断的AUC(Z=3.183,P=0.002)(图2、表3)。

图2 外周血Foxp3和RANTES水平诊断原因不明复发性流产的ROC曲线

表3 外周血Foxp3和RANTES水平对原因不明复发性流产的诊断价值

讨 论

复发性流产会使子宫内膜变薄、导致宫腔粘连,也易出现盆腔感染和盆腔炎,严重则导致不孕,除了对患者身体造成一定损伤外,也会对患者心理上带来伤害,出现焦虑、抑郁等消极情绪,影响工作和生活[11-12]。及时诊断对患者维持正常妊娠也具有重要意义,因此,外周血Foxp3联合RANTES对原因不明复发性流产的诊断价值值得探讨。

Foxp3主要表达于人类胸腺、淋巴结、脾脏等淋巴器官及组织中,人Foxp3基因定位于染色体Xp11.23,影响免疫失衡相关疾病的发生发展[13-14]。曹智等[15]研究表明,Foxp3在子宫内膜异位症患者异位内膜组织中的阳性率高于正常组织,有望成为该疾病治疗靶点。本研究结果显示,与正常妊娠孕妇外周血Foxp3水平比较,原因不明复发性流产孕妇外周血Foxp3水平显著降低,与赵广彩等[8]的研究结果一致。本研究进行的Spearman相关性分析也显示,外周血Foxp3水平与原因不明复发性流产的发生存在一定相关性,提示Foxp3与原因不明复发性流产的发生有关。进一步分析外周血Foxp3水平对原因不明复发性流产的诊断价值发现,外周血Foxp3水平诊断原因不明复发性流产发生的AUC达0.820,特异度和敏感较高,表明其诊断价值较高。

RANTES是趋化性细胞因子CC亚族成员,又称CCL5,人RANTES基因位于染色体17q11.2-q12区域,是维持正常妊娠的重要基因[16]。张腾飞等[17]的研究发现,子宫内膜异位症患者经治疗后,血清RANTES水平降低,症状得到改善。本研究中原因不明复发性流产孕妇外周血RANTES水平显著低于正常妊娠孕妇,且外周血RANTES水平与原因不明复发性流产的发生存在显著相关性,提示原因不明复发性流产的发生可能与RANTES异常表达有所关联。陈慧等[9]的研究中,不仅发现原因不明复发性流产的发生与RANTES有关,还发现RANTES与患者流产次数有关。本研究ROC分析表明,外周血RANTES对原因不明复发性流产具有一定诊断价值,且Foxp3和RANTES联合诊断的AUC和敏感度高于二者单独诊断,提示二者联合对原因不明复发性流产的诊断价值更高,有望成为早期诊断及判断疗效的指标。

Th17和Treg是不同的T细胞亚群,Th17能够分泌IL-17等促炎因子,从而介导机体炎症反应,而Treg是维持机体免疫耐受的关键因子,能够调节机体免疫力;Th17数量增加、Treg数量减少不利于母体免疫耐受的维持,导致流产的发生[18]。本研究发现,相比于正常妊娠对照组,病例组Th17比例和Th17/Treg显著升高,而Treg显著降低,提示原因不明复发性流产孕妇Th17比例和Treg细胞失衡,导致母体免疫系统排斥胚胎,影响胚胎发育,最终造成流产。徐彩等[19]进行的动物试验表明,自拟固胎煎对复发性流产小鼠的治疗作用可能与改善免疫平衡及蜕膜环境有关。本研究进一步采用Pearson分析法分析原因不明复发性流产孕妇外周血Foxp3和Th17、Treg、Th17/Treg的关系,结果表明,外周血Foxp3、RANTES水平均与Th17、Th17/Treg呈显著负相关,与Treg均呈显著正相关。结合前人研究结果推测Foxp3、RANTES均与机体免疫系统平衡密切相关,Foxp3通过调节多种基因的表达影响Treg的活性,RANTES与相应受体结合后,对CD4+T细胞产生趋化作用,但其中具体作用机制尚不清楚,有待后续深入研究[20-21]。

综上所述,Foxp3和RANTES水平均与原因不明复发性流产孕妇的免疫平衡失调有关,且二者联合对原因不明复发性流产的诊断价值较高。但由于本研究例数较少,Foxp3和RANTES对原因不明复发性流产的诊断价值仍需进一步验证;此外,Th17与炎症反应关系密切,本研究尚未对两组研究对象的炎症因子水平进行比较,有待完善。