荆防颗粒对脂多糖致小鼠急性肺损伤的预防和保护作用

赵玉升 张 盈 程国良 姚景春 曹天佑 吴 同 孔 慧 屈会化 赵 琰 张贵民

(1 北京中医药大学中医学院,北京,100029; 2 鲁南制药集团股份有限公司/中药制药共性技术国家重点实验室,临沂,276000; 3 北京中医药大学中药学院,北京,100029; 4 北京中医药大学中医药研究院,北京,100029)

急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)是急性呼吸窘迫综合征的早期阶段,其特点是由于促炎途径和氧化途径的激活而引起迅速而强烈的炎症反应,导致肺组织中性粒细胞积聚,间质水肿,肺泡上皮损伤,随后肺细胞外基质重塑,在临床上表现为呼吸障碍和顽固性低氧血症,可进一步发展为严重的呼吸障碍[1-2]。尽管在治疗策略和对相关呼吸生理的认识方面取得了重大进展,ALI患者的死亡率仍高达40%[3]。研究表明,革兰氏阴性菌感染是引起ALI的重要原因之一,革兰氏阴性菌外膜的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可引起肺损伤和一系列炎症反应[4-5]。目前为止,临床上尚未有有效的治疗方法来提高该病的存活率,世界各地的患者只能接受支持性治疗,现有治疗ALI的药物多为皮质类固醇药物,但这些药物往往会产生严重的不良反应。因此,迫切需要安全有效的防治药物。

荆防颗粒源于古代抗疫名方荆防败毒散,由提取物浸膏和大量辅料组成,是采用现代制药工艺加工而成的中成药制剂。荆防败毒散出自明代的《摄生众妙方》,主要由荆芥、防风、柴胡、川芎、羌活、独活、前胡、茯苓、桔梗、枳壳、甘草共11味中药组成,具有解表散寒、宣肺祛湿的功效,是治疗病毒性呼吸道感染疾病的经典名方[6]。该方以荆芥、防风为君药,祛风解表;羌活、独活祛湿止痛,柴胡和解表里,川芎祛风止痛,为臣药;佐药桔梗开提肺气,枳壳降气行痰,一升一降,宽胸利气,配前胡以疏风化痰,升降清浊,茯苓渗湿利水,使补而不滞;甘草调和诸药为使药。诸药合用,具有发汗解表、散风祛湿、宣利肺气之功效。

荆防颗粒已在临床上用于治疗病毒性呼吸道感染疾病和人支原体肺炎,且疗效确切,患者临床症状改善明显[7-8]。自2020年已被国内新疆、云南、四川等地的《新冠病毒感染的中医药防治方案》中指定为新冠肺炎预防推荐用药,用以治疗新冠病毒感染轻症[9-10]。本研究拟从实验角度探讨荆防颗粒对LPS所致ALI模型小鼠的治疗作用,从炎症和氧化应激水平来研究其治疗ALI的作用机制,为其进一步的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级C57BL/6雄性小鼠50只,体质量18～22 g,由北京斯贝福生物技术有限公司提供,生产合格证号为SYXK(京)2020-0033。实验期间动物均饲养于同一环境下,保持室温(24.0±1.0)℃,相对湿度55%～65%,12 h明暗交替,通风良好,饲养期间内自由进水、进食,适应性喂养3 d后进行实验,取材前12 h小鼠禁食不禁水。本实验相关动物实验遵循北京中医药大学有关实验动物管理和使用的规定,并通过伦理委员会批准(伦理批准号:BUCM-4-2021-092202-3084)。

1.1.2 药物 荆防颗粒(鲁南制药集团股份有限公司,批号:80022202002);LPS(Sigma公司,德国,批号:L2880)。

1.1.3 试剂与仪器 单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1)试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司,批号:SEA087Mu);白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司,批号:SEA079Mu);白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司,批号:SEA563Mu);肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司,批号:SEA133Mu);考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:A045-2-2);髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:A044-1-1);诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:A014-1-2);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:A003-1-2);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:A001-3-2);谷胱甘肽(Glutathione,GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:A006-2-1)。电子分析天平(赛多利斯,德国,型号:BS124-S);电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司,型号:DRP-9082);酶标仪(美国伯腾仪器有限公司,美国,型号:EL 800);超速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司,型号:HC-2518R);石蜡包埋机(沈阳誉德电子仪器有限公司,型号:SYD-B-F);石蜡切片机(徕卡,美国,型号:Leica RM2016);倒置荧光显微镜(尼康,日本,型号:Nikon Eclipse Ti-SR)。

1.2 方法

1.2.1 分组和模型制备 将50只C57BL/6J小鼠随机分为5组,每组10只,分别为对照组、模型组、荆防颗粒低剂量组(1.25 g/kg)、荆防颗粒中剂量组(2.5 g/kg)、荆防颗粒高剂量组(5 g/kg)。动物适应饲养环境后,各荆防颗粒给药组按照相应浓度连续灌胃给药6 d,对照组和模型组均以灌胃的方式给予同体积的生理盐水,连续6 d。在第6天时,称重,给药1 h后,模型组和各荆防颗粒给药组进行LPS气管滴注(5 mg/kg),制备出ALI模型,对照组小鼠气管滴入相同体积生理盐水。

1.2.2 给药方法 荆防颗粒制备:荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、枳壳、茯苓、桔梗、川芎各4.5 g,炙甘草1.5 g,制备成浸膏,1 g浸膏相当于原药材1.082 34 g,配置荆防颗粒低、中、高剂量组(1.25 g/kg、2.5 g/kg和5 g/kg,分别相当于临床剂量的0.156 25、0.312 5和0.625倍),放入冰箱保存,使用时混合均匀即可。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 一般情况观察 观察各组小鼠造模前后的一般情况,包括精神、呼吸、肤色、毛发、排泄物和对外界刺激的反应,并记录各组造模前后小鼠的体质量、死亡数量。

1.2.3.2 肺组织形态学观察 造模12 h后,对小鼠进行麻醉,脱颈椎处死,剪开胸廓,暴露并小心取出全肺,避免取出过程中对肺组织造成损伤。之后使用生理盐水来反复轻柔冲洗肺组织上残留血液,用滤纸轻轻擦拭多余水分后进行拍照、称重。

1.2.3.3 病理学分析 将小鼠左肺放入4%多聚甲醛溶液中进行固定,经不同浓度的乙醇梯度洗脱后,经常规石蜡包埋,切片厚6 μm,进行苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色,中性树胶封片,于光学显微镜下观察肺组织病理学变化,并进行病理学评分。评分标准参考相关研究,在双盲状态下观察肺水肿、肺泡及间质炎症细胞浸润、间质出血形成3个检查项目,主观定量评分分别为0～4分,标本无病变为0分,全视野为4分,病理评分为上述各项指标之和。

1.2.3.4 肺组织中炎症介质指标检测 将肺组织置于4 mL离心管中,按重量(g):体积(mL)加入9倍体积生理盐水匀浆,3 500 r/min,离心10 min,取上清为待测样品。采用ELISA法检测MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,所有操作步骤严格根据试剂盒的说明书进行。

1.2.3.5 肺组织中氧化应激指标检测 取上述冻存后的剩余肺组织,室温解冻后,在冰水浴中研磨制成10%的肺组织匀浆液,3 500 r/min,离心10 min,离心半径15 cm,离心后取上清液,按照试剂盒说明书进行操作,分别检测肺组织中MPO、MDA、iNOS、SOD和GSH的含量。

2 结果

2.1 荆防颗粒对ALI小鼠一般情况的影响 造模前各组小鼠精神状态良好,呼吸稳定,活动正常,对外界刺激敏感,无震颤、俯卧等异常行为,排泄正常。造模12 h后,与对照组比较,模型小鼠精神状态较差,几乎无活动,平躺且毛发凌乱、暗淡无光泽,排泄物变稀。在给药6 d以及造模12 h后,小鼠体质量前后变化不大,且造模后均未出现小鼠死亡情况。

2.2 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织宏观形貌的影响 ALI的主要病理特征为肺组织中性粒细胞积聚,间质水肿,肺泡上皮损伤。与对照组比较,气管滴注LPS的小鼠肺部出现广泛的厚层暗红色出血,提示肺部有严重的出血以及炎症反应,处于强烈受损状态。见图1A～1B。在经过预给药后,荆防颗粒各给药组肺部受损状态均得到不同程度的恢复,肺部出血面积减少。与模型组比较,荆防颗粒低剂量组的肺部颜色较模型组更红润光滑,但仍有一部分出血点,治疗效果最差;荆防颗粒中剂量组肺部出血面积情况得到一定程度好转,治疗效果居中;荆防颗粒高剂量组肺部呈现红润,仅可隐约见到小部分出血点,治疗效果最好。见图1C～1E。从宏观形态上可以看出,荆防颗粒可以一定程度上逆转LPS所致ALI,具有一定的预防治疗效果。

图1 荆防颗粒改善LPS诱导ALI小鼠肺组织的宏观图像

2.3 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织病理变化的影响 观察对照组肺组织中肺泡结构正常,肺泡腔室清晰可见,肺泡壁细长且结构清晰,未见到明显的红细胞和炎症细胞浸润。见图2A。与对照组比较,模型组小鼠肺组织中的肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤,肺泡壁毛细血管扩张充血,炎症细胞和红细胞穿透肺泡腔和肺间质,肺泡形状发生改变,肺泡壁和间隔明显增厚,肺组织受损明显,这提示LPS造模成功。见图2B。与模型组比较,荆防颗粒各剂量给药组受损肺组织在经过预给药治疗后均能够得到不同程度的恢复。其中,荆防颗粒高剂量组小鼠肺组织病变明显改善,红细胞以及炎症细胞数量程度得到减轻,肺组织形态结构趋于正常;荆防颗粒中剂量、低剂量组小鼠肺组织的肺泡腔和肺间质炎症细胞和红细胞的浸润程度减轻,但仍可见部分出血点。见图2C～2E。

图2 荆防颗粒对LPS诱导ALI小鼠肺组织病理学影响(HE染色,×100和×200)

从病理评分结果可以看出,与对照组比较,模型组小鼠肺组织病理评分显著升高,提示肺组织受损情况严重,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,在经过荆防颗粒预给药治疗后,各给药组小鼠肺组织的病理评分均显著下降,差异有统计学意义(P<0.01),以荆防颗粒高剂量组的治疗效果最优。见表1。以上结果表明,荆防颗粒对LPS所致ALI具有一定的治疗效果,且呈现一定的剂量依赖性。

表1 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织病理变化的影响

2.4 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中MCP-1含量的影响 与对照组比较,模型组小鼠肺组织中的MCP-1含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),表明单核细胞被LPS激活,并从外周血液循环进入肺组织,从而导致肺内单核细胞数量激增;与模型组比较,荆防颗粒低、中、高剂量组就能有效抑制ALI小鼠肺组织中MCP-1的异常表达,差异有统计学意义(P<0.01),其中以高剂量组的治疗效果最优。见表2。

表2 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中MCP-1含量的影响

2.5 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响 与对照组比较,模型组小鼠肺组织中TNF-α的含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,经过预给药治疗后的荆防颗粒低、中、高剂量均能不同程度降低TNF-α的水平,差异有统计学意义(P<0.01),其中,以中、高剂量组的治疗效果较优。荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中IL-1β的水平的影响与TNF-α类似。与对照组比较,模型组小鼠肺组织中IL-1β含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,荆防颗粒中、高剂量组均能明显降低肺组织中IL-1β的水平,差异有统计学意义(P<0.01),荆防颗粒低剂量组也具有一定的治疗效果,差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,模型组小鼠肺组织中IL-6含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,荆防颗粒高剂量组能显著降低IL-6的水平,差异有统计学意义(P<0.01),荆防颗粒中、低剂量组对IL-6的异常升高也具有一定的抑制作用,但以高剂量组的效果最优。见表3。

表3 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响

2.6 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中MPO、iNOS和MDA含量的影响 与对照组比较,模型组中的MPO含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,荆防颗粒低、中、高剂量组均能显著降低肺组织中MPO的含量,差异有统计学意义(P<0.01),其中以荆防颗粒高剂量组的治疗效果最为显著。与对照组比较,模型组小鼠的iNOS水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,荆防颗粒高、中剂量组能明显降低iNOS含量,差异有统计学意义(P<0.01),荆防颗粒低剂量组也表现出一定的抑制效果,差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,模型组小鼠的MDA水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)与模型组比较,荆防颗粒高、中、低剂量组均能在一定程度上降低MDA的含量,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。见表4。

表4 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中MPO、iNOS和MDA含量的影响

2.7 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中抗氧化酶SOD和GSH含量的影响 与对照组比较,模型组中的SOD和GSH水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),反映出LPS所致ALI小鼠肺组织的氧化应激水平较为严重;与模型组比较,荆防颗粒高、中剂量组能明显升高肺组织中的SOD和GSH含量,差异有统计学意义(P<0.01),提高了机体的抗氧化能力,荆防颗粒低剂量组也能增加肺组织中的SOD和GSH水平,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 荆防颗粒对ALI小鼠肺组织中SOD和GSH含量的影响

3 讨论

荆防颗粒化学成分种类丰富,含有黄酮以及黄酮苷、香豆素类、木脂素类、萜类、醛类、酯类、芳香醚类、有机酸类、糖苷类等化合物,梁红宝等[10]利用GC-MS技术和UPLC-Q Exactive MS技术对荆防颗粒中的醇溶性有机成分以挥发性成分进行定性分析,共分离鉴定出109个化合物,并对其进行药材归属,这为荆防颗粒的药效物质基础研究及质量标准制定提供了可靠的实验依据。同时,化合物的有效性和安全性是其成药性的关键,团队前期对荆防颗粒的毒性作用开展了深入研究,结果表明荆防颗粒在10 g/(kg·d)剂量下不会引起动物一般体征、体质量、摄食量、血液生化学、组织病理学、性发育和性激素水平、生长发育等指标的异常改变,且对大鼠围产期发育、大鼠胚胎-胎仔发育无毒性反应,这为其进一步的药理研究以及临床应用提供了剂量依据[11-15]。

荆防颗粒的处方来源于明代《摄生众妙方》一书中所载的荆防败毒散,荆防败毒散在治瘟疫功效显著,为古代治疫第一方,而荆防颗粒在现代多用于治疗流行性及传染性疾病。现代研究表明,荆防颗粒具有广泛的药理作用,如调节转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白(Smad)4信号通路来抑制四氯化碳所致小鼠肝纤维化;激活磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase,Pi3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)信号通路来发挥解酒保肝作用;抑制细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase,ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinases,MAPK)信号通路来减轻角叉菜胶所致小鼠尾部血栓;抑制Ⅰ型变态反应抗体IgE的生成和组胺的释放,有效控制大鼠荨麻疹[16-19]。此外,荆防颗粒的临床疗效也得到了初步评价,如荆防颗粒治疗风寒证感冒方面疗效显著,能降低患者血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平,有效缩短病程,改善临床症状与体征;荆防颗粒联合阿奇霉素治疗成人支原体肺炎患者疗效确切,能有效减少患者体温恢复时间、咳嗽消失时间以及肺部啰音消失时间;荆防颗粒内服治疗扁平疣也具有较好的临床疗效[8,20-22]。可见,荆防颗粒药效明确,尤其治疗肺部感染疾病疗效甚佳。

ALI是由感染、有害物质吸入、创伤、休克等多种非心源性致病因素作用下导致的一种临床常见危重症之一,其实质是过度的炎症反应将引起肺泡毛细血管膜损伤,血管通透性增强,导致含蛋白质的液体流入肺间质和肺泡腔,造成非心源性肺水肿[23]。目前,对于ALI造模方法包括LPS诱导[24]、石墨粉诱导[25]、高氧诱导[26]、流感病毒诱导[27]等。其中,LPS所致ALI模型是用来评价药物疗效的经典模型,其病理机制是LPS能引发中性粒细胞在肺内的聚集和激活,进一步释放氧自由基、弹性蛋白酶等诱导免疫细胞释放炎症介质,而炎症介质能够促进中性粒细胞的大量渗出及黏附,从而引起级联性炎症反应,最终引起肺损伤[28]。本实验结果表明,无论从宏观图像还是病理切片上来看,经过不同剂量的荆防颗粒预给药治疗后均可以明显抑制LPS所引起的肺部水肿、炎症细胞浸润以及出血症状,肺组织破坏程度得到有效改善,这表明荆防颗粒在预防和治疗LPS所引起的肺损伤具有良好的疗效。

急性炎症反应在ALI中起着关键作用,可直接或间接导致肺泡上皮和微血管内皮的损伤,是LPS所致ALI发病的主要来源。MCP-1是单核细胞和嗜碱性粒细胞的趋化因子,参与炎症反应以及免疫调节过程,在以单核细胞浸润为特征的疾病发病机制中发挥关键作用[29]。近年来研究表明,MCP-1在人类多种肺部疾病中,如脓毒症、新冠肺炎等疾病中的表达水平会出现异常上升[30-31]。本研究结果表明,荆防颗粒高、中、低剂量组均可有效抑制LPS所致肺部MCP-1含量的异常升高,减少肺部炎症细胞的浸润。TNF-α是LPS所致肺损伤过程中最早由单核-巨噬细胞释放的细胞因子,不仅可以破坏内皮细胞,还能刺激其他炎症介质的释放[32]。IL-1β和IL-6是机体重要的炎症介质,可诱导中性粒细胞在肺部聚集,从而加重炎症反应[33]。同时,中性粒细胞的聚集是肺部炎症的关键环节,作为中性粒细胞的功能和驱动标志,MPO是衡量中性粒细胞浸润组织的有效指标[34]。LPS作用于机体后,能够引起IL-1β、IL-6和MPO的异常升高,是评价ALI严重程度的特征指标。本实验检测结果表明,荆防颗粒高、中、低剂量组均能不同程度降低模型小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和MPO的含量,且以高剂量的治疗效果最优,这表明荆防颗粒可有效抑制LPS所引起的肺部急性炎症反应,且呈现出一定的剂量依赖性。

氧化应激是指活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的持续生成使有机抗氧化防御系统的能力超负荷,导致DNA、蛋白质和脂质损伤,是ALI发生的重要机制之一[35]。LPS作用于机体后能够增加ROS的产生,导致体内氧自由基生成与抗氧化电位的不平衡,进而诱导炎症细胞聚集,加重肺部损伤[36]。iNOS是存在于机体的重要炎症介质,在氧化应激损伤时表达增加,可产生大量一氧化氮,进而诱导组织损伤[37]。MDA是氧自由基作用于脂类的氧化产物,其含量随着脂类膜结构和功能的破坏而增加,而SOD和GSH是人体内重要的抗氧化酶,在过度的氧化应激水平下可减少自由基的产生,提高机体的抗氧化能力[38]。从实验结果来看,荆防颗粒高、中、低剂量组一方面能够降低模型小鼠肺组织中的MDA含量,同时还能提高SOD和GSH等抗氧化酶的活性水平,这表明荆防颗粒能有效LPS所诱导的氧化损伤,提高机体的抗氧化和清除自由基的能力。

综上所述,荆防颗粒对LPS致小鼠肺损伤具有一定的预防和保护作用,能有效改善肺组织形态及病理学变化,其作用机制一方面可能是抑制炎症细胞的分泌,从而发挥抗炎作用;另一方面可能与降低氧化应激水平、提高机体的抗氧化能力有关。以上实验结果为荆防颗粒临床应用提供了实验依据。同时,荆防颗粒药效缓和,临床适用人群范围广,更有利于在临床上推广应用。

利益冲突声明:无。