莱阳梨膏对咳嗽模型鼠的改善作用研究

■ 寇宇宁 徐登辉 林瑞麒 童 陈 冯孟阳 李 蕊 张佳欣 于蕾妍

（青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200）

咳嗽是机体呼吸系统对抗有害物质的一种自我防御机制[1]，当外界有害物质刺激呼吸道黏膜的感觉神经纤维末梢时，会引发咳嗽反射，将有害物质排出体外。咳嗽的同时也会造成呼吸道损伤，积累活性氧和自由基[2]，从而引发炎症反应[3]。中医认为咳嗽的原因是外邪袭肺和内邪干肺[4]。而梨膏在中医上记载有清热润肺、养阴益胃之功效，常用于治疗外邪袭肺导致的咳嗽[5]。

古法熬制莱阳梨膏可以最大程度保留其抗氧化成分，具有生津润肺、化痰止咳的作用。梨膏的主要成分为原儿茶酸、绿原酸、熊果苷、阿魏酸、没食子酸和儿茶素等6 种酚类化合物[6]。酚类化合物解离的氢离子易与自由基的电子结合，清除自由基，减少氧化应激[7]。此外，熊果苷还可以抑制炎性因子的生成[8]，从而实现抗炎作用。

多杀性巴氏杆菌是导致猪肺疫和猪萎缩性鼻炎等呼吸道疾病的主要病原体，对养猪业发展构成严重威胁。研究表明，莱阳梨膏的主要成分酚类化合物对多杀性巴氏杆菌表现出良好的抑菌活性[9]，将其添加于动物饲料中，可以通过抑菌及镇咳作用来缓解症状，促进康复，达到替抗的效果。此外，天然植物制品还可以减少氧化应激、降低动物消化和生殖系统的疾病发病率[10]，改善动物机体因氧化应激导致的繁殖障碍和生长性能下降的问题[11]。将天然植物制品用于饲料添加剂，具有绿色、健康、无害的特点，可实现健康养殖。因此，试验旨在探究不同剂量下莱阳梨膏对咳嗽模型鼠的改善作用效果，为养殖医药的健康发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

无特定疫病（SPF）昆明种小白鼠，体重36～40 g，雌雄各半，由青岛大任富城畜牧有限公司提供，合格证号：syxk（鲁）2020—0009。

1.1.2 试验药品

25%氨水（分析纯，AR）、冰醋酸（分析纯，AR）：莱阳市康德化工有限公司；生理盐水，山东科伦药业有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（A001-2-1）、过氧化物酶（POD）试剂盒（A084-1-1）、丙二醛（MDA）试 剂 盒（TBA 法）（A003-1-2）、谷 胱 甘 肽（GSH）试剂盒（A006-1-1），南京建成生物工程研究所有限公司；莱阳梨膏：市售。

1.1.3 试验仪器

SQP 电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，江苏科析仪器有限公司；TGM-16M 台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超声波雾化器，海尔集团公司；752 型紫外可见分光光度计，上海舜宇横平科学仪器有限公司；旋涡混匀仪，湖南比克曼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模（浓氨水引咳法）

小鼠禁食禁水8 h，置于玻璃钟罩下，超声波雾化器喷雾25%氨水15 s，立即取出小鼠。记录2 min 内咳嗽次数及潜伏期，2 min 内咳嗽大于10 次者为合格[12]。造模后自由饮水采食，适应期2 d。

1.2.2 分组与给药

选取小鼠50 只，随机分为高剂量（12 g/kg 莱阳梨膏）、中剂量（6 g/kg 莱阳梨膏）组和低剂量（3 g/kg莱阳梨膏）组，枸橼酸喷托维林阳性组（0.01 g/kg）以及空白对照组（生理盐水），每组10 只。每日按0.2 mL/10 g分别灌胃给药，连续给药10 d。

1.2.3 敏感性测定

每日给药前禁食禁水8 h。于末次给药1 h后，按

1.2.1 所述造模方法引咳，记录2 min 内咳嗽次数及潜伏期（注：小鼠咳嗽的表现为头向前伸，嘴长大，腹肌强烈收缩，可听见轻微咳嗽声；潜伏期是指从开始喷雾至产生咳嗽的时间[13]）。

1.2.4 小鼠血清SOD水平测定

称取小鼠体重（g），清理小鼠眼球周围毛发，采用无麻醉眼球取血法收集各组小鼠的全血，将收集好的血液样本4 ℃冷藏静置1 h 后，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，取血清进行SOD 水平测定。操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 小鼠肺脏组织丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量与过氧化物酶（POD）活性的测定

眼球取血完毕后，将小鼠浸泡消毒，无菌操作立即取出肺脏，切取适宜的重量，置玻璃组织匀浆器中，按1∶9 的比例加入9 倍体积的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.2）进行研磨，制成10%肺脏组织匀浆液。取匀浆液3 500 r/min 离心15 min，取上清液进行MDA、GSH 含量与POD 活性的测定。操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 小鼠脾脏指数测定

按照1.2.5 的操作取出脾脏，称重（g），计算脾脏指数。

脾脏指数（SI）=脾脏重量（g）×1 000/体重（g）

1.2.7 数据分析

试验采用SPSS 27.0 进行单因素方差分析（oneway ANOVA），Duncan’s 法进行各组间差异的多重比较，采用Origin 2022 软件绘图（美国OriginLab 公司），计量资料以“平均值±标准差（）”表示。P＜0.05 为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 莱阳梨膏对浓氨水引咳模型小鼠的镇咳作用

如图1 所示，与空白对照组相比，高、中剂量组均可显著延长小鼠的咳嗽潜伏期（P＜0.05），而低剂量组差异不显著（P＞0.05）；与阳性对照组相比，高剂量组潜伏期较短，具有显著性差异（P＜0.05）。

与空白对照组相比，高、中剂量组均可显著减少小鼠2 min 内咳嗽次数（P＜0.05），低剂量组有一定镇咳作用，但不具有显著差异（P＞0.05）。与阳性对照组相比较，高剂量组咳嗽次数相近，且无显著差异（P＞0.05）。

2.2 莱阳梨膏对小鼠血清SOD、肺脏组织POD 活性的影响

如图2 所示，与空白对照组相比，高、中、低剂量组均可提高SOD、POD 活性，且高剂量组具有显著差异（P＜0.05）。图3、图4 表明，高剂量组SOD、POD 提高率分别为45.36%、7.78%。

图2 莱阳梨膏对小鼠血清SOD、肺脏组织POD活性的影响

图3 莱阳梨膏对小鼠血清SOD的影响

图4 莱阳梨膏对小鼠肺脏组织POD的影响

与阳性对照组相比，高剂量组POD 活性与其相近，SOD 活性表现出更优异的效果，不具有显著差异（P＞0.05）。

试验表明适宜浓度的莱阳梨膏能提高SOD、POD活性，对修复细胞的损伤有一定的作用，且在提高SOD 活性方面表现出优越性，具有超过阳性对照组的效果。

2.3 莱阳梨膏对小鼠肺脏组织MDA、GSH含量的影响

如图5 所示，与空白对照组相比，高、中剂量组均可显著提高小鼠肺脏组织GSH含量，高剂量组可显著降低MDA 含量（P＜0.05）。低剂量组也具有相同效果，但与空白对照组相比，MDA、GSH含量无显著差异（P＞0.05）。图6、图7 表明，高剂量组GSH 提高率、MDA降低率分别为120.62%、24.38%。

图5 莱阳梨膏对小鼠肺脏组织MDA、GSH含量的影响

图6 莱阳梨膏对小鼠肺脏组织GSH的影响

2.4 莱阳梨膏对小鼠脾脏指数的影响

高剂量组小鼠肺脏组织GSH 含量略低于阳性对照组，MDA 含量略高于阳性对照组，与镇咳药效果相近，且均无显著差异（P＞0.05）。

试验表明莱阳梨膏可提高GSH 含量，降低MDA含量，从而增强机体对氧化应激的抵抗能力并修复细胞损伤。

如图8 所示，高、中、低剂量组脾脏指数均高于空白对照组，且与空白对照组相比，高剂量组具有显著差异（P＜0.05），低、中剂量组不具有显著差异（P＞0.05）。因此，适宜浓度的莱阳梨膏可促进小鼠脾脏的生长，提高小鼠的免疫能力。

3 讨论

3.1 莱阳梨膏对咳嗽模型鼠镇咳作用的影响

小鼠通过氨水引咳的方法造模，氨水经超声雾化后进入小鼠的呼吸道 ，对呼吸道痛觉神经末梢产生刺激，刺激传到咳嗽中枢引起咳嗽反应[14]，同时会对小鼠肺部造成急性损伤[15]。经过10 d 的莱阳梨膏灌胃，与空白对照组比较，高、中、低剂量组均可使小鼠咳嗽次数减少、咳嗽潜伏期延长，且高剂量组差异显著。同时在减少咳嗽次数方面，高剂量组与阳性对照组极为相近。目前市面上镇咳药物的种类繁多，但都存在着难以避免的副作用。例如，可待因、右美沙芬和氯哌斯汀等[16]，作为依赖性中枢镇咳药物，常常带来成瘾和神经系统损害等副作用。

试验发现，适宜浓度的莱阳梨膏具有良好的镇咳效果，莱阳梨膏的镇咳效果与常用镇咳药物相似，且没有镇咳药物的副作用。同时还具有滋阴润肺、清热泻火功效。

Li 等[17]在古法熬制梨膏过程中产生了N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-天冬氨酸（Fru-ASP），发现Fru-ASP 可以通过下调炎性介质，减轻肺水肿来缓解小鼠急性肺损伤，并减少小鼠咳嗽次数。另外，Alsharif等[18]发现，原儿茶酸可以通过抑制高迁移率族蛋白B1（Hmg B1）依赖的NF-κB 信号通路抑制小鼠炎症反应，从而减轻肺损伤。由此推断，莱阳梨膏的镇咳效果可能与Fru-ASP 及原儿茶酸均可缓解肺损伤的作用有关。

Ahmet 等[19]研究表明，富含酚酸、类黄酮等酚类化合物的天竺葵提取物能够缓解犊牛因呼吸道疾病引起的咳嗽、发热等症状。莱阳梨膏也是一种含有丰富酚类化合物的物质，且在小鼠试验中表现出镇咳的效果。因此，莱阳梨膏在畜牧动物生产方面的潜在作用值得进一步研究探索。

3.2 莱阳梨膏对咳嗽模型鼠抗氧化能力的影响

自由基是一类含有自由电子的化学物质，常见的自由基包括：超氧负离子（O2-·）、过氧化氢（H2O2）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）等。主要由机体氧化性损伤产生，自由基会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物丙二醛（MDA），不可逆地破坏生物膜[20]。另外，MDA 易进入组织与蛋白质、核酸形成共价键，导致酶和多肽等以氨基酸为结构基础的活性物质遭到破坏，改变细胞的结构和功能[21]。故机体中MDA 含量可以侧面反应过氧化物的含量和机体损伤程度[22]。本研究发现，服用不同浓度梨膏后，小鼠肺脏组织MDA 含量显著下降，这说明梨膏具有保护肺脏免受氨水诱导的氧化损伤的能力。为对抗自由基的攻击，小鼠体内的抗氧化系统被激活，产生SOD、POD 和GSH，分别能够清除超氧负离子、催化H2O2的分解和作为自由基清除剂[23]，起到减轻机体氧化应激的作用。本研究发现，服用不同浓度梨膏后，小鼠血清SOD 活性、肺脏组织POD、GSH 含量显著上升。这可能与梨膏中的酚类化合物有关。POD 和SOD 还能通过协同作用[24]共同提高机体的抗氧化能力。

Keap1-Nrf2 与抗氧化酶的转录密切相关。Wang等[25]发现绿原酸可以通过下调Keap1 的表达水平来激活Nrf2/ARE 信号通路，该信号通路会上调内源性抗氧化酶（如SOD、GSH）的mRNA 的表达水平，从而抑制氧化应激。Lende 等[26]的研究表明，原儿茶酸对于卡拉胶引起小鼠水肿导致的氧化应激有良好的减缓效果，其中高剂量原儿茶酸可以使SOD、GSH 和过氧化氢酶（CAT）活性明显上升。因梨膏的主要成分包含绿原酸和原儿茶酸等物质，由此可推断，莱阳梨膏的抗氧化能力可能是多种有效成分共同作用的结果。

3.3 莱阳梨膏对咳嗽模型鼠免疫能力的影响

脾脏是机体最大的免疫器官，淋巴细胞的增殖、免疫器官的增重都可以反应免疫能力[27]。Chen 等[28]的研究发现，黄梨的提取物（多糖）对免疫抑制小鼠的免疫器官发育有促进作用，从而分泌更多的肿瘤坏死因子α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）等免疫因子，增强免疫能力。此外，李梦云等[29]研究表明，刺梨提取物（多酚、黄酮等）也可以达到提高脾脏指数的效果。本试验显示，服用莱阳梨膏的高剂量组小鼠脾脏指数相比空白对照组显著升高，这表明梨膏具有一定的免疫刺激活性，可以提升免疫器官的功能，可能是梨属植物共同的活性成分的作用（如多糖、多酚类、总三萜等物质）[30]。

4 结论

本研究探讨了不同浓度梨膏对咳嗽小鼠的镇咳效果及其抗氧化能力。结果显示，梨膏能够显著降低小鼠咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期，且与常用镇咳药相近。梨膏还能提高小鼠血浆SOD活性、肺脏组织POD活性和GSH 含量，降低肺脏组织MDA 的含量，表明梨膏具有抗氧化作用，能够减轻氧化应激，还能增加小鼠脾脏指数。综上所述，高剂量（12 g/kg）梨膏是一种具有潜力的医药健康用药，值得深入探究其功效和机理。