贝莱斯芽孢杆菌生物学特性及体外降解霉菌毒素研究

■ 曹艳子 王效禹 顾艳丽 杨慧杰 江国托 崔亚微，3 刘 艳 林 洋*

（1.大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连 116036；2.辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110036；3.沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866）

微生物制剂以其易生长、易发酵、产生益生物质种类多、无残留及耐药性等多重优势被研究人员关注。尤其是芽孢杆菌具有产酶、产维生素、产益生素、产酸、耐受性强、保湿性强、占位迅速等优势，广泛应用于临床中[1-3]。贝莱斯芽孢杆菌为一种新型芽孢杆菌，学术界经过多次讨论及更改最终定义为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），是一种生防菌，革兰氏阳性，大小为0.5 µm×（1.5～3.5） µm，杆状，芽孢呈椭圆形，中生，末端膨大为孢子囊，能够通过鞭毛运动，菌体聚合一起呈短链或念珠状排列，是一种对环境无毒无害的天然性生防菌，同时具有广谱的抗菌活性及较强的抗应激能力，易于分离和培养，代谢产物丰富，对人类和动植物无害，在农业、环境工程及发酵工业中有巨大的应用前景[4-5]。本研究考察了一株自主分离的贝莱斯芽孢杆菌的生物学特性，进行了生长性能、抗逆性和产酶能力、发酵液成分及毒素降解能力效果等研究，以期为该菌株在畜禽养殖中应用提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

贝莱斯芽孢杆菌（革兰氏染色及16S rDNA 鉴定后命名为BLS-1）、大肠杆菌标准菌株（O1、O2、O78、O139和O141），由大连三仪动物药品有限公司实验室提供。

1.2 主要试剂和材料

大豆蛋白胨，购自山东淄博启迪生物制品有公司；琼脂粉、酵母浸粉、磷酸氢二钾，购自天津科密欧化学试剂有限公司；口服葡萄糖，购自潍坊盛泰药业有限公司；胰蛋白胨，购自北京双旋微生物培养基制品厂；猪胆盐，购自北京索莱宝科技有限公司；抗生素药敏纸片，购自杭州滨河微生物有限公司；霉菌毒素标准品，购自天津阿尔塔生物科技有限公司；检测试剂盒，购自北京亿森宝生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

TGL-20M 型高速台式冷冻离心机，购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DT5-3 型低速自动平衡离心机，购自北京医用离心机有限公司；UP900 型超纯水机，购自Human Corporation 公司；SW-CJ-1F 型医用洁净工作台，购自苏州市华宇净化设备有限公司；LS-B53U 型立式压力蒸汽灭菌器，购自上海医用核子仪器厂；DNP-9022型电热恒温培养箱，购自上海精宏实验设备有限公司；TH2-C 型恒温摇床，购自太仓市实验设备厂。

1.4 方法

1.4.1 初始pH和温度对菌株生长的影响

采用盐酸调节发酵培养基，pH 为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将BLS-1菌液分别按1%接种量接种于50 mL不同pH的发酵培养基中，混匀，分别置于180 r/min条件下，37 ℃摇床培养24 h，通过活菌平板计数测定结果。

采用发酵培养基中培养的BLS-1 菌液，以1∶100（V/V）比例转接至新鲜的发酵培养基中，180 r/min，分别在25、30、33、37、40 ℃恒温摇床中培养24 h，通过活菌平板计数测定结果。

1.4.2 菌株抗逆性研究

1.4.2.1 菌株抗生素敏感性测定

为了检测贝莱斯芽孢杆菌BSL-1 对抗生素的敏感性，采用纸片琼脂扩散法（K-B 法）检测其对15 种抗生素（包括头孢哌酮、头孢他啶、链霉素、头孢氨苄、恩诺沙星、阿奇霉素、新霉素、强力霉素、头孢拉定、氨苄西林、阿莫西林/棒酸、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、卡那霉素）的敏感特性。将BLS-1单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃摇床培养过夜，将菌液用无菌水调至1×108CFU/mL，取200 µL菌液涂布LB固体平板，待干后在无菌条件下将药敏片按标记好的位置小心放平，置于37 ℃恒温温箱中培养20 h，取出观察测量抑菌圈直径，参照药敏片说明书判断药物的敏感性。

1.4.2.2 菌株胆盐耐受性测定

将猪胆盐分别加入到发酵培养基中，使其终浓度为0、0.1%、0.3%、0.5%，调pH 至（7.0±0.2），将菌株按1%接种量接种于不同猪胆盐发酵培养基中，每个浓度设3个重复，180 r/min振荡培养0、0.5、1、2 h和3 h，利用活菌平板计数测定结果。

1.4.2.3 菌株耐酸性测定

将发酵培养基的pH 分别调至2.5、3.0、3.5，将BLS-1 菌液按1%接种量分别接种于各发酵培养基中，每个pH 设3 个重复，180 r/min 振荡培养0、1、2 h和3 h，进行活菌平板计数测定结果。

1.4.2.4 菌株胃肠液耐受性测定

将BLS-1 菌液按1%的接种量分别接入50 mL 人工胃液和50 mL 人工肠液中，37 ℃、140 r/min 摇床培养，每组设3个重复，在0、0.5、1、2 h和3 h进行活菌平板菌落计数。

1.4.2.5 菌株的大肠杆菌抗性测定

采用牛津杯法，制备大肠杆菌指示菌液为1×108CFU/mL 数量级，取100 µL 于LB 平板涂布均匀，放置牛津杯，吸取200 µL 样品（分别为发酵液B1、离心上清液B2、上清过滤液B3、菌体）放入牛津杯中，置于37 ℃温箱中培养24 h，观察记录结果[6-8]。

1.4.3 菌株生长曲线绘制

将BLS-1 菌液按1%接种量接种于200 mL 发酵培养基的三角瓶中，设3个重复，分别于培养的0～34 h每隔2 h各重复组取样2 mL 培养液，通过活菌平板计数测定各样品的活菌数及芽孢数，记录结果。

1.4.4 菌株发酵液成分测定

将菌株按1%接种于发酵罐中，以165 r/min 的转速进行发酵，分别于18、30 h取样测定酶、维生素的含量（采用常规生化法及高效液相色谱法）。

1.4.5 菌株降解霉菌毒素的研究

按1.4.4 的方法发酵贝莱斯芽孢杆菌48 h，采用发酵液原液对玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）、伏马毒素（FB）、黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB）、赭曲霉毒素（OT）进行体外降解[9]。无菌条件下在19.90 mL样品中加入0.1 mL霉菌毒素标准品，其中ZEN 是在14.25 mL 样品加入0.75 mL 标品，分别于0、24、48 h取样待测。

1.5 统计分析

所有数据均利用SPSS 22.0 进行统计分析，数据结果采用“平均值±标准差”的形式表示，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株最适pH及温度

2.1.1 pH对菌株生长的影响

pH 对微生物生长及菌量具有一定的影响，因此筛选贝莱斯芽孢杆菌最适生长pH尤为重要。按1%的接种量将BLS-1接种于不同pH的培养基中，振荡培养24 h，计数活菌数，结果见图1。由图1 可知，当pH=6时，该菌株活菌数量最高，达到25.95×108CFU/mL。表明发酵液pH是6时为BLS-1的最适培养条件。

图1 pH对菌株生长的影响

2.1.2 温度对菌株生长的影响

按1%的接种量将BLS-1 接入发酵培养基中，置于不同温度（25、30、37、40 ℃）下振荡培养24 h，计数活菌数，结果见图2。由图2 可知，当温度为37 ℃时活菌数量最多，达到21.1×108CFU/mL，说明37 ℃为BLS-1的最佳培养温度。

图2 温度对菌株生长的影响

2.2 贝莱斯芽孢杆菌的抗逆性研究

一株性能优良的益生菌必须具有良好的抗逆性，才能顺利起到益生作用[10]。本研究对筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌BLS-1的胆盐、酸、胃肠液、抗生素的耐受性及大肠杆菌抗性进行了考察和分析。

2.2.1 不同浓度胆盐对菌株生长的影响

由图3 可知，在0 h 时各组间无差异，作用1 h 时胆盐添加量0.1%、0.3%、0.5%的活菌数量组间无显著差异，均低于浓度为0 的对照组（P＜0.05）；作用2 h 时胆盐添加量为0.1%的组与对照组无显著差异（P＞0.05），与添加量为0.3%、0.5%的组差异极显著（P＜0.01），且添加量为0.3%、0.5%两组间有显著差异（P＜0.05）。各试验组在不同胆盐浓度作用3 h 情况下，该菌株能够耐受0.3%以下的胆盐浓度，且活菌存活率达95%以上，而在胆盐浓度为0.5%时活菌率达75%左右。

图3 不同浓度胆盐对菌株生长的影响

2.2.2 不同酸度对菌株生长的影响

由图4 可知，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 在pH 为2.5时培养3 h后存活率为68%，在pH为3.0时培养3 h后存活率为86%，在pH 为3.5 时培养3 h 后存活率为91%。说明该菌株能够耐受pH 为2.5～3.5 的强酸环境，该菌可顺利通过在胃部，保证活菌达到肠道中，起到益生作用。

图4 不同酸度对菌株生长的影响

2.2.3 胃肠液对菌株生长的影响

由图5 可知，肠液有促进贝莱斯芽孢杆菌BLS-1生长的趋势，整个试验过程中，人工肠液组的活菌数在培养1 h 后超过空白对照组，考虑可能是肠液组成成分可促进芽孢发育、菌株生长，BLS-1 菌株能够适应肠液环境。人工胃液组与空白对照组培养0.5 h 活菌数差异较大，培养3 h差异更大，但仍有贝莱斯芽孢杆菌存活，证明贝莱斯芽孢杆菌BLS-1可以通过复杂的胃环境顺利到达肠道发挥其益生作用。

图5 胃肠液对菌株生长的影响

2.2.4 菌株抗生素敏感性测试

抗生素对细菌有一定的抑制作用，所以益生菌产品要与抗生素错峰使用，避免达不到应用效果，同时对抗生素敏感也表明此菌的可控性，不会成为不可控益生菌。抗生素敏感性测试结果见表1。

从表1 可知，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 对上述所提供的抗生素均敏感，头孢哌酮、头孢氨苄、恩诺沙星、新霉素、头孢拉定、阿莫西林/棒酸、氨苄西林、环丙沙星的敏感度明显高于阿奇霉素、强力霉素。因此，可判定此株贝莱斯芽孢杆菌可安全应用，且不易产生耐药性，在临床应用时需与上述抗生素分开或隔段时间使用，以达到更好应用效果。

2.3 菌株抑制大肠杆菌的效果

目前养殖业中大肠杆菌严重影响动物生长性能，治愈率低、病死率高，临床中难以根治，大肠杆菌的定居因子、黏附素、肠毒素是主要致病原因，所以不仅要抑制细菌还要清除内毒素。抗生素的过量应用有耐药、残留的危险，中兽药价格昂贵，药效好但速度慢，而微生物进入胃肠道后可迅速靶位定殖，并产生益生物质抑制致病菌达到促生长作用。贝莱斯芽孢杆菌BLS-1的大肠杆菌抗性试验结果见表2。

表2 贝莱斯芽孢杆菌BLS-1抑制大肠杆菌的效果（平均值±标准差，mm）

从表2 可知，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 发酵48 h 后得到的发酵液（B1）、离心上清液（B2）、上清过滤液（B3）及菌体均对大肠杆菌有不同程度的抑制效果。其中发酵液（B1）对5 株大肠杆菌标准菌株均有中度敏感，发酵液（B1）对大肠杆菌O1的抑菌效果高于离心上清液（B2）、上清过滤液（B3）及菌体的抑菌效果（P＜0.05）；发酵液（B1）和菌体对大肠杆菌O78抑制作用显著优于离心上清液（B2）（P＜0.05）；离心上清液（B2）和菌体对大肠杆菌O141的抑菌效果优于发酵液（B1）和上清过滤液（B3）（P＞0.05）；发酵液（B1）、离心上清液（B2）和菌体对大肠杆菌O139的抑菌效果显著优于上清过滤液（B3）。由此可见，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 的菌株及发酵液对大肠杆菌均具有抑制效果，具体临床应用效果需要通过试验验证。

2.4 贝莱斯芽孢杆菌BLS-1的生长曲线

生长曲线在微生物应用及研究中具有重要作用，主要分为四个时期，即迟缓期、对数期、稳定期及衰老期。通过其生长曲线可以掌握微生物的生长规律，对于后续产业化开发具有重要意义。

由图6 可知，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 在发酵培养0～12 h为延迟生长期即迟缓期，12 h后进入对数生长期，持续至18 h，从18～34 h 进入稳定期，并在28 h 该菌株芽孢形成数达到最高，BLS-1 菌株活菌数趋于稳定。此结果可为指导该菌株的发酵生产工艺提供参考依据。

图6 贝莱斯芽孢杆菌BLS-1的生长曲线

2.5 贝莱斯芽孢杆菌BLS-1发酵液产酶情况

酶分为内源酶和外源酶，可打开植物细胞壁，有效地将饲料原料消化而被机体吸收利用。内源酶是机体自身分泌的，有助于食糜消化吸收；外源酶是为了补充内源酶分泌不足及种类不全，可加快饲料消化，促进营养物质吸收。

由图7 中可知，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 在发酵过程中可产生中性蛋白酶（Sarre peptidase）、碱性蛋白酶（Alkaline protease）、胃蛋白酶（Pepsin）、β-淀粉酶（beta-Amylase）、β-1，3-1，4-葡聚糖酶、胰蛋白酶（Trypsin）、糜蛋白酶（Chymotrypsin）、脂肪酶（LPS）、锰过氧化物酶（Mnp）、葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化氢酶（CAT）、内切-β-1，4-葡聚糖酶（Endo-β-1，4-glucanase）、几丁质酶（Chitinase）。其中β-淀粉酶、脂肪酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、几丁质酶含量较高，根据成本及发酵效率考虑，发酵18 h 为最佳发酵时间，发酵30 h 则相对成本高且达不到最佳效果。另外发现，在发酵18、30 h 时发酵液中胃蛋白酶酶活分别为82.41、45.96 U/mL；在发酵18 h时β-淀粉酶酶活为2 158.37 µg/（min·mL）、发酵30 h 时β-淀粉酶酶活为1 957.38 µg/（min·mL）。

图7 贝莱斯芽孢杆菌BLS-1发酵液中酶的活性

2.6 贝莱斯芽孢杆菌BLS-1发酵液产维生素情况

维生素B1含量最高为菌株发酵18 h；维生素B2含量最高为菌株发酵30 h；维生素B6含量最高为原菌株发酵18 h，综合成本及发酵时间最佳为发酵18～30 h（见图8）。

2.7 菌株降解霉菌毒素的效果

霉菌毒素对畜禽养殖危害巨大，可导致饲料营养成分损失、适口性差，影响食欲、诱发畜禽霉菌性气囊炎及肠炎等，同时会损伤黏膜，易发生呼吸道疾病和免疫抑制。还可抑制家禽免疫系统、损伤生殖系统及消化系统，导致肝肾功能下降[11]。

由图9 可知，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 对伏马毒素、呕吐毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素均有不同程度的降解作用。5 种毒素在24、48 h比0 h 均有下降趋势，在降解48 h 试验中，玉米赤霉烯酮降解率最，高达到62.04%，其他依次为呕吐毒素为61.63%、黄曲霉毒素为50.60%、赭曲霉毒素27.07%、伏马毒素20.60%；降解初期24 h 试验中，同样是玉米赤霉烯酮降解率最高，达到61.00%，其他依次为呕吐毒素52.76%、黄曲霉毒素4.78%、赭曲霉毒素3.03%、伏马毒素1.80%。通过以上结果也可以看出，贝莱斯芽孢杆菌BLS-1 发酵液对霉菌毒素均有降解作用，在临床中可根据不同的需求对发酵工艺进行调整。

图9 贝莱斯芽孢杆菌体外降解霉菌毒素效果

3 讨论

贝莱斯芽孢杆菌在自然界中广泛分布，具有抗逆性、生长迅速、易分离等优良生物学特性，具有易培养、安全无害、无污染等优点。同时其发酵后可产生丰富的代谢产物，具有良好的抗菌活性及抗应激能力。有报道表明，贝莱斯芽孢杆菌可产生抑制霉菌及降解霉菌毒素的次级代谢产物，如酶类（几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、过氧化氢酶）、抗菌物质（抗菌蛋白、脂肽类抗生素、非核糖体多肽合成酶、聚酮化合物合成的抗生素等）、植物激素等[12-13]。

以β-淀粉酶为例，其可以用于畜禽食欲不振、消化不良、胃黏膜炎等，在临床上应用广泛，如可提高断奶仔猪的日增重及饲料转化率，弥补内源酶的不足；提高育肥猪的生长速度及免疫力；提高肉鸡增重及饲料转化率并能降低可溶性非淀粉多糖（NSP）导致的食糜黏度过大，利于细胞内营养物质的释放，减少蛋鸡养殖中脏蛋的数量；促进反刍动物消化吸收、增重及产奶等。在水产养殖中，同样可提高饲料消化吸收利用，降低饲料成本。其他酶同样可达到相关的作用且不同酶种有自己对应的作用。酶持续产生为畜禽养殖提供丰富的外源酶，也会在临床生产中达到可观的效果。蛋白酶可将营养物质中的蛋白质分解为机体所需的氨基酸、蛋白胨等有益物质。几丁质酶为贝莱斯芽孢杆菌产生的独特的酶，在体外有抑菌作用，能够抑制孢子萌发和菌丝生长，甚至直接降解真菌细胞壁的几丁质，使菌丝粗缩畸形，甚至完全消解，同时对一些线虫和昆虫具有良好的抑制效果，因此可将此菌用于饲料原料的脱霉脱毒及畜禽养殖中的除霉脱毒领域。

贝莱斯芽孢杆菌发酵产物中含有丰富的维生素。维生素B1（硫胺素）可维持神经系统安宁，促进消化和身体细胞的代谢功能，促进糖的代谢并可通便。缺少时引起浮肿、多发性神经炎等疾病。维生素B2（核黄素）可促进发育、促进产蛋，有益于肝功能，抗惊觉，缺少时会引起胚胎发育不良、皮肤炎症等。维生素B6（吡哆素），包括吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺三种形式，参与碳水化合物和脂肪的代谢，鸡缺乏维生素B6时引起贫血、生长缓慢、共济失调、腿软不能站立、种鸡产蛋率和孵化率下降。维生素B9(叶酸)对神经系统、血液和细胞生理机能发挥着重要作用。贝莱斯芽孢杆菌可产生多种维生素，因此在畜牧兽医行业中应用可以起到多重功效。

基于此，有学者报道贝莱斯芽孢杆菌具有添加剂的潜质，其作为饲料添加剂能够改善畜禽肠道微生物菌体结构、调节机体脂代谢、增强免疫力及抗病力、促进饲料消化吸收、除霉降解毒素等[14-15]。

目前，芽孢杆菌属具有抗恶劣环境且具有益生作用被广泛用于畜禽养殖[16]，被批准作为饲料添加剂，有大部分芽孢杆菌具有降解霉菌毒素的能力[17-18]。如Zhu 等[19]筛选得到的芽孢杆菌对玉米赤霉烯酮有降解作用；Ul-Hassan 等[20]发现蜡状芽孢杆菌和蜜梳状孢类芽孢杆菌对T-2 毒素有降解作用；Chen 等[21]发现可降解黄曲霉毒素的解淀粉芽孢杆菌；Zhai 等[22]发现一株厌氧条件下降解玉米赤霉烯酮的梭状芽孢杆菌；Watanakij 等[23]分离的枯草芽孢杆菌可降解黄曲霉毒素。可见国内外学者的研究逐渐偏向霉菌素素的生物降解法，尤其是微生物法降解法。

尽管现在很多益生菌应用于临床中，但大部分益生菌耐受性低，乳酸菌类对生长及储存条件要求严格，另有一些益生菌价格昂贵、生产成本高，实际临床用不起，且部分益生菌常温存活率低，真正用于临床时效果并不如实验室研究时的效果明显。在这种情况下，开发新型具有抗逆性、易于生产、可产生多种益生物质且可在恶劣环境下生存、实验室生物学特性明显、临床应用效果优良的优势菌株是重中之重[24-25]。尤其霉菌在饲料原料及饲料中的滋生，造成动物饲粮的严重污染，动物食入后，严重影响动物的繁殖能力、消化吸收能力、生产性能、免疫功能等。因此，找到一种既具有益生作用，又具有抑制细菌霉菌、脱霉脱毒的微生物可为畜禽养殖及疫病防控提供保障[26-27]。

4 结论

本研究获得一株抗逆性好、产酶、抑菌性能良好的贝莱斯芽孢杆菌BLS-1，其发酵平稳期短（20～30 h），便于生产，易于工业优化。其最适生长温度为37 ℃，最适pH为6，耐受胆盐、高温、胃肠液、酸，可产蛋白酶和纤维素酶，对抗生素敏感，可抑制大肠杆菌，在本试验发酵过程中可产生多种酶及维生素，同时本株菌的发酵液原液可降解伏马毒素、呕吐毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素，可为日后产业化生产及临床应用提供基础。