2022 年山东地区商品肉鸡15 株H9N2亚型禽流感病毒HA 基因的遗传演化分析

邵明辰，董伟峰，刘兆洁

（1.山东省鲁南牧工商有限公司，山东 枣庄 277500；2.山东省莱州市文昌路畜牧兽医站，山东 莱州 261499；3.广东省华晟生物技术有限公司，广东 广州 511400）

H9N2 是A 型流感病毒的一个亚型，具有高度空气传播性，可引发商品肉鸡流感，同时该病毒还严重影响人类公共卫生安全。我国自1998 年就开始进行H9N2 亚型禽流感病毒（AIV）的防疫，但目前其疫苗株与流行株的抗原性已经出现了较大的差异[1]。商品肉鸡因养殖密度大、通风不良等原因，冬春季极易引起流行，造成生产中的严重损失。虽然H9N2 亚型流感病毒属于低致病性，但与大肠杆菌、支原体等混合感染后可引起免疫抑制和死亡增多，造成肉鸡养殖业的巨大经济损失[2]。

H9N2 禽流感病毒自1966 年首次在美国分离后，逐渐在北美、亚洲、中东、非洲和欧洲许多国家家禽体内发现，根据地理位置不同可分为北美和欧亚两个体系。目前该病在亚洲地区分布较广。

1994 年我国广东地区首次公开报道H9N2 亚型禽流感病毒。 HA 基因是A 型流感病毒致病性的主要影响因子。 根据HA 序列，将H9N2 分为h9.1～h9.4，共4 个主干进化分支。当前，我国流行的主要为h9.4.2.5 和h9.4.2.6 两个分支，但仍以h9.4.2.5 为主。本文选取了来自山东地区发病商品肉鸡分离的15 株H9N2 禽流感病毒，用特异性引物对HA 基因进行扩增并测序，比对其HA 基因同源率，探讨HA 基因遗传演化特点，为商品肉鸡低致病性禽流感H9N2 的防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 毒株

15 株H9N2 亚型商品肉鸡分离株由广东省华晟生物技术有限公司分离鉴定保存，方法参照文献[3]，并分别命名为A/CK/SD/11/2022/H9N2、A/CK/SD/15/2022/H9N2、A/CK/SD/16/2022/H9N2、A/CK/SD/17/2022/H9N2、A/CK/SD/19/2022/H9N2、A/CK/SD/21/2022/H9N2、A/CK/SD/29/2022/H9N2、A/CK/SD/30/2022/H9N2、A/CK/SD/31/2022/H9N2、A/CK/SD/32/2022/H9N2、A/CK/SD/50/2022/H9N2、A/CK/SD/51/2022/H9N2、A/CK/SD/52/2022/H9N2、A/CK/SD/53/2022/H9N2、A/CK/SD/54/2022/H9N2。

H9-2203-C（4.2.5c）、HeB210813-2F6-b（4.2.5b）、H9-2102-a（4.2.5a）参考毒株HA 序列由华南农业大学兽医学院提供。

1.2 主要材料和试剂

SPF 鸡（胚）由广东新兴大华农禽蛋有限公司提供。试验所用分子生物学试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物合成

利用参考文献[3]中的H9N2 禽流感病毒HA基因引物序列，由广州核源生物科技有限公司合成，用于扩增HA 基因全长序列，预期扩增的HA基因大小为1 687 bp。扩增所用引物序列详见表1。

表1 扩增所用引物序列

1.4 病毒RNA 的提取及RT-PCR 扩增、测序

参照试剂盒说明书进行病毒RNA 提取。RTPCR 扩增、连接克隆、序列测定参照文献提出的方法进行[4]。

1.5 遗传进化分析

15 株分离毒株、8 株H9N2 禽流感参考毒株的HA 基因序列（表2）以及华南农业大学兽医学院提供分型的3 株H9N2 毒株HA 基因序列，用MEGA6.0 进行遗传演化分析，绘制系统进化发育树。

表2 8株H9N2禽流感参考毒株的HA基因序列信息

2 结果

2.1 HA 基因的同源性和遗传分析

将11 株（8+3）参考毒株与15 株H9N2 病毒分离株的HA 基因进行遗传演化分析，获得如图1 所示的进化树。

图1 HA基因遗传进化树

从图1 进化树可以看出，15 株分离毒株均属于4.2.5 分支，细分为2 个亚分支。其中，12 株分离毒株属于4.2.5c 分支，3 株分离毒株属于4.2.5a分支。图2 中，15 株H9N2 分离毒株之间的HA序列相似性在93.3%～99.9%之间。同一亚分支4.2.5a 分支间的毒株相似性在99.8%～99.9%之间，4.2.5c 分支间的毒株相似性在95.6%～99.9%之间，差异较小，但不同亚分支间的毒株相似性差异较大。根据以往经验，相似性差异大于1.5%就能形成分支间的差异，因此分析这些毒株的抗原性可能也会存在明显差异。

图2 HA基因核苷酸同源率

2.2 关键位点分析

15 株分离株的HA 裂解位点呈现弱毒株的序列特征，均为RSSR ↓GLF。受体结合位点分析发现W161 和G236 符合其绝对保守氨基酸位点的特征，没有出现其他氨基酸的突变。12 株病毒（11/15/16/17/19/30/50/51/52/53/54）在163 位点为N 突变，3 株病毒（29/31/32）在163 位点为T 突变，198 位点均为V 突变。所有分离株存在234L和236G（表3）。以上突变位点均与受体特异性相关，说明所有分离株都有感染哺乳动物的风险。

表3 HA基因关键位点分析

3 讨论

流感病毒的HA 基因裂解位点氨基酸序列是其致病性和毒力的主要影响因子[5]。本研究中15个H9N2 分离毒株的HA 基因裂解位点具有低致病性流感病毒分子特征，裂解位点氨基酸序列为RSSR ↓GLF，没有连续的多个碱性氨基酸插入。

测序鉴定的15株H9N2毒株均属于4.2.5分支，此分支是当前国内商品肉鸡H9N2 病毒的主要流行分支。病毒分布在4.2.5 分支内部的2 个亚分支中，2 个分支之间病毒的HA 基因存在明显的相似性差异，暗示病毒的抗原性之间也可能存在较大差异。Sun 等[6]发现，H9N2 病毒流行株同源性之间呈现时间和地理位置的一致性；不同的是，较早期病毒均有不同程度的变异和进化。本研究中，通过对15 株H9N2 分离毒 HA 基因进化树分析可知，从地理位置上分离毒呈现出两种不同的同源性关系，从分支上隶属于4.2.5a 和4.2.5c 亚分支，出现了地理位置的不一致性。当前国内商品肉鸡使用的H9N2 灭活疫苗基本是单一毒株，抗体交叉可能存在差异，提示肉鸡场需要兼顾两种不同亚分支毒株的免疫。

H9N2 禽流感病毒对公共安全也有潜在威胁[7]。15 株分离毒株的HA 基因关键位点突变均呈现出典型的人流感受体结合特性，具有234L和236G 的特征，以上突变位点均与受体特异性相关，病毒均具备感染哺乳动物的风险，提示相关从业人员应该加强生物安全防护，避免其产生严重的公共危害。