樟子松固沙林地可培养溶磷细菌的筛选及鉴定

李建男，郝若尧，樊丽婷，李玉萌，张胜男，孟建宇

（1. 内蒙古农业大学生命科学学院旱寒区环境微生物学与技术实验室，内蒙古 呼和浩特 010011；2. 内蒙古自治区林业科学研究院，内蒙古 呼和浩特 010010）

磷是植物生长必需的第二营养元素， 对植物的生长发育有着重要作用， 磷可以加速植物的根系和幼芽的生长，促进细胞分裂，促进植物的呼吸作用和养分和水分的吸收；促进植物脂肪、蛋白质、碳水化合物的代谢、合成、运转；提高植物的抗旱、抗寒、抗病和抗盐碱的能力，并增强植物的抗逆性，改善产品的品质；缩短根瘤的发育和存活时间，增加根瘤的体积、数量和氮素同化量，促进豆科植物根系的生长，提高豆科植物产品的含氮量和产量。 磷元素往往以难溶性磷的形式存在，植物很难吸收利用，所以在低水平可利用磷素的樟子松林地， 可利用磷的缺失必定会严重影响其幼苗的生长[1]。

樟子松 （Pinus sylvestris） 是一种具有抗旱、耐寒、耐贫瘠、抗病虫害等抗逆能力的针叶树种[2]，在我国西北、华北、东北地区广泛分布，在遏制土地荒漠化、保护当地的农牧生态系统中起着重要的作用。但是，近几年樟子松固沙林出现了严重的退化[3]。 有研究表明， 樟子松固沙林土壤含磷量处于我国森林生态系统土壤磷素含量的最低水平[4]，生长在荒漠地区的樟子松生长本就受干旱胁迫影响， 再加上土壤中可利用的磷含量较低，严重影响了樟子松的生长。

大量研究表明， 土壤中存在大量的溶磷菌（Phosphate Solubilizing Bacteria，PSB）， 溶磷菌是指能够将土壤中不溶性磷转化为可被植物吸收利用的磷的一类细菌。 目前发现具有溶磷作用的细菌有芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞杆菌（Pseudomonas）、欧文氏菌（Erwinia）、土壤杆菌（Agrobacterium）、沙雷氏菌（Serratia）、 黄杆菌 （Flavobacterium）、 肠杆菌（Enterbacter）、 微球菌 （Micrococcus）、 固氮菌（Azotobacter）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、沙门氏菌（Saimonella）、色杆菌（Clromobacterium）、产碱菌（Alcaligenes）、 节杆菌 （Arthrobacter）、 硫杆菌（Thiobacillus）、埃希氏菌（Escherichia）[5-6]等。 有研究发现，将溶磷菌接种于植物后能显著增加土壤及植株的磷、钾、镁等矿质元素含量[7-9]，而且溶磷菌还可以改善植物根际微生物群落结构，并对植物生理指标有积极影响[10]。 邢芳芳等[11]分离得到的解磷菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对白菜具有明显的促生作用，经其处理后，白菜叶片数、叶绿素，以及产量都得到明显提高，这说明本研究具有一定的可行性。

鉴于此， 本研究对辽宁省彰武县樟子松固沙林的土壤样品中的溶磷菌进行分离鉴定、 测定溶磷能力、分析固沙林土壤中的溶磷菌类群，旨在为后续溶磷菌能否对植物尤其是生存环境较差的植物产生促生效果提供理论基础， 在不破环生态环境的基础上使用微生物对植物的生长产生积极影响， 并且可以丰富功能根际促生细菌资源库以及开发新的改善土壤磷素营养的途径， 并为后续微生物肥料研发及樟子松固沙林修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 土壤样品采自辽宁省彰武县章古台试验基地，利用多点采样法，选取7 点去除土壤表面枯枝落叶，收集深度为0～20 cm 的土壤，装入无菌采样袋，混合均匀后，置于4 ℃车载冰箱中，运回实验室进行溶磷细菌的分离和纯化。

1.1.2 培养基配方[12]无机磷固体培养基：葡萄糖10 g·L-1，硫酸铵0.5 g·L-1，氯化钠0.3 g·L-1，氯化钾0.3 g·L-1，七水硫酸镁0.3 g·L-1，磷酸钙5 g·L-1，七水硫酸亚铁0.03 g·L-1， 一水硫酸锰0.03 g·L-1， 琼脂20 g·L-1，蒸馏水1 000 mL，pH 值7.4～7.6。

R2A 液体培养基：酵母粉0.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，酸水解酪蛋白胨0.5 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，淀粉0.5 g·L-1，磷酸氢二钾0.3 g·L-1，丙酮酸钠0.3 g·L-1，七水硫酸镁0.05 g·L-1，TES 2 mL，蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤细菌分离 称取土样1 g，加入100 mL，无菌水，放入摇床中振荡30 min，静置至土壤全部沉淀，吸取上清液依次按照1∶10 的比例稀释。 取土壤悬浮液100 μL， 分别涂布在无机磷固体培养基上，每个梯度的稀释液做3 组重复，倒置放入培养箱中，在28 ℃条件下，培养3～5 d。挑取形态不同的单一菌落进行划线纯化培养。

1.2.2 菌株的16S rDNA 的鉴定及其同源性分析按照试剂盒TIANamp Bacteria DNA Kit（China）的操作步骤提取DNA。 取细菌培养液3 mL，10 000 r·min-1离心1 min，吸上清液。 向沉淀物中加入200 μL 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。 向离心管中加入20 μL proteinase K 溶液，混匀。加入缓冲液GB 220 μL，振荡15 s，在70 ℃水浴锅中放置10 min，待离心管中溶液变清澈后， 短暂离心。 加入无水乙醇220 μL，振荡15 s。将之前获得的溶液及絮状沉淀加入到一个CB3 吸附柱中，然后放入离心管中，12 000 r·min-1离心30 s， 倒掉废液， 将吸附柱放入收集管中。 向CB3 吸附柱中加入缓冲液GD 500 μL，12 000 r·min-1离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。 向CB3 吸附.柱加入漂洗液PW 500 μL，12 000 r·min-1离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。 将吸附柱放入收集管中，12 000 r·min-1离心2 min，倒掉废液，将CB3 吸附柱置.于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中的漂洗液。 将CB3 吸附柱放入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间悬空滴加洗脱缓冲液TE 120 μL， 室温静置5 min，12 000 r·min-1离心2 min，将溶液收集到离心管中。 至此对细菌DNA 提取完成。 接下来对菌株的16S rDNA 进行扩增。 菌株的16S rDNA 基因扩增引物为细菌通用引物27F 和1492R。 PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序得到的16S rDNA 序列通过Blast-n （Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query(nih.gov)）与Nucleotidecollection（Home-Nucleotide-NCBI（nih.gov））数据库进行比对，用MEGA 6.0 构建系统发育树。

1.2.3 菌株的溶磷能力测定 将分离纯化的溶磷菌接种至R2A 液体培养基中， 待菌株浓度生长至1×108CFU·mL-1时， 按1%接种量接种至无机磷液体培养基中， 放入温度为28.5 ℃， 转速为180 r·min-1的振荡培养箱中培养2 d。 吸取上清液10.00 mL 于25 mL 比色管中， 缓慢加入钼锑抗显色剂5.00 mL，缓慢摇动，排出二氧化碳后，加水定容至25.00 mL，充分摇匀。 在室温高于20 ℃处， 放置30 min， 用1 cm 光径玻璃比色皿在波长880 nm 处比色，测量吸光度。

吸取磷标准溶液 （磷标准使用液）0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL， 于25 mL 色管中，加入NaHCO3浸提剂10.00 mL， 钼锑抗显色剂5.00 mL，慢慢摇动，排出二氧化碳，后加水定容至25.00 mL。此系列溶液中磷的浓度依次为0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 μg·mL-1。 将溶液放置在室温高于20～30 ℃处，放置30 min，用1 cm 光径玻璃比色皿在波长880 nm 处比色，用系列溶液的零浓度调节仪器零点，测量吸光值，绘制标准曲线并计算回归方程。 计算公式如下：

有效磷测定值（mg·kg-1）=（ρ×V×D）/（m×103）×103式中，ρ 为溶液中磷的质量浓度 （μg·mL-1）；V 为显色液体积，25 mL；D 为分取倍数， 即试样提取液体积/显色时分取体积，本试验为50/10；M 为风干试样质量（g）。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌的筛选

本研究从辽宁省彰武县樟子松固沙林地土壤样本中共分离获得3 株具有较强溶磷能力的细菌，其编号分别为30-3、30-4 和36-5（表1）。 其中，菌株30-3 和30-4 的溶磷能力较强， 溶磷量均为37.63 mg·L-1；菌株36-5 的溶磷能力相对较弱，其溶磷量为32.24 mg·L-1。本研究分离到的菌株都是常见的具有溶磷能力的菌属，溶磷能力属于中等水平。

2.2 系统发育分析

根据16S rDNA 的测序结果与NCBI 数据库进行比对， 对菌株30-3、30-4、36-5 进行系统发育进化分析，并构建系统进化发育树（图1）。 由图1 可知，菌株30-3 与Bacillus aryabhattai处于同一分支，亲缘关系较近，其序列同源性为99%；菌株30-4 与Paenibacillus tyrfis处于同一分支，亲缘关系较近，其序列同源性为99%；菌株36-5 与Rhizobium jaguaris处于同一分支， 亲缘关系较近， 其序列同源性为99%。 因此，3 株菌株分属芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和根瘤菌属（Rhizobium）。

图1 基于16SrDNA 序列构建的系统发育进化树

3 讨论与结论

本研究对辽宁省彰武县樟子松固沙林土壤中的可培养溶磷细菌进行分离纯化和鉴定， 获得3 株具有较强溶磷能力的细菌， 其编号和近缘种分别为30-3（Bacillus aryabhattai）、30-4（Paenibacillustyrfis）和36-5（Rhizobium jaguaris）。 蔺宝珺等[13]从高寒草甸土壤中分离出数量最多的溶磷菌为芽孢杆菌属（Bacillus.sp）；孟建宇等[14]从内蒙古荒漠灌木根内分离出12 株具有溶磷能力的菌株，其中有5 株细菌属于芽孢杆菌属 （Bacillus.sp）， 占分离总菌株数的41.67%；孟建宇等[15]从内蒙古鄂尔多斯荒漠5 种灌木根际土中分离出62 株具有溶磷能力的细菌，其中芽孢杆菌属（Bacillus.sp）为优势属，占分离总菌株数的17.74%。 本研究也分离得到一株芽孢杆菌，说明芽孢杆菌属可能在溶磷菌中占有较大的百分比。 本研究结果表明， 菌株30-3 （Bacillus aryabhattai）和30-4（Paenibacillus tyrfis）具有较强的溶磷能力，且溶磷量都为37.63 mg·L-1； 菌株36-5（Rhizobium jaguaris）也具有一定的溶磷能力，其溶磷量为32.24 mg·L-1，说明芽孢杆菌属（Bacillus）与类芽孢杆菌属（Paenibacillus） 的溶磷能力可能强于根瘤菌属（Rhizobium）。 有研究表明，Bacillus对难溶性磷酸盐的溶解量为647.8 mg·L-1， 溶解有机磷的溶磷量为26.6 mg·L-1[16]。陈俊等[17]从红树林植物根际中分离出Paenibacillus ginsengagri，溶磷量为52.88 mg·L-1。 李剑锋等[18]从兰州市西北部属温带半干旱大陆性气候分离出Rhizobiumsp.，溶磷量为6.98 mg·L-1。通过以上的研究结果对比可知， 筛选出来的溶磷菌溶磷能力差异可能与其生存环境有关。 有研究表明，Bacillus除了具有溶磷作用之外，还具有一定的耐盐性，可在20%NaCl 浓度下生长[19]。周妍等[20]发现，从绿豆根际土中分离的溶磷菌能够促进植物在盐胁迫下生长。 闫杨等[21]发现，Bacillus对土壤关键酶活性有一定的影响；Paenibacillus具有解钾能力[22]，可以分泌植物体内重要的激素-吲哚乙酸 （IAA）[23]，IAA不仅可以促进植物生长同时可以增强植物干旱胁迫抗性[24]。 王志刚等[25]从齐齐哈尔龙江县辣椒根际土中得到3 株具有产IAA 能力的溶磷菌；Rhizobium具有耐碱能力[26]以及固氮能力[27]。根据16S rDNA的测序结果与NCBI BLAST 数据库进行比对， 对菌株30-3、30-4 和36-5 进行系统发育进化分析并构建系统进化发育树， 本研究发现菌株30-3 与Bacillusaryabhattai亲缘关系较近；菌株30-4 与Paenibacillus tyrfis亲缘关系较近； 菌株36-5 与Rhizobium jaguaris亲缘关系较近。 吴倩倩等[28]在荒漠地区锦鸡儿属植物中筛选出Bacillus，且是6 种不同锦鸡儿内生菌的优势菌群。 李丽[29]从中国西北地区分离到159 株根瘤内生细菌， 其中Paenibacillus有31 株，而且除了具有溶磷能力之外还具有产蛋白酶的能力；Rhizobium有25 株，除了具有溶磷能力之外，还具有固氮的能力，对植物生长都有着积极的影响，但是其能力是随机的而且不稳定。 综上所述，土壤中存在具有溶磷能力的细菌，这些溶磷菌不仅可以提高土壤中可溶磷的含量，同时还能通过分泌自身代谢产物来促进植物生长，并提高植物的抗逆能力。

本研究从辽宁省彰武县樟子松固沙林中分离出3 株溶磷细菌， 编号分别为30-3、30-4 和36-5，其最近缘物种分别为Bacillus aryabhattai、Paenibacillus tyrfis和Rhizobium tropici， 经过测定均具有较强的溶磷能力。由此可知，辽宁省彰武县樟子松固沙林土壤中具有较多种类的溶磷细菌， 将溶磷菌用于微生物肥料， 可为微生物磷肥的生产和开发提供菌种资源， 为解决樟子松人工固沙林土壤可溶磷含量低的问题提供理论依据， 对促进绿色农业的发展具有重要意义。