茯茶素B 通过下调PLK1 抑制宫颈癌细胞增殖

余松林，刘缘，甘琳，欧阳，胡治远

（湖南城市学院 黑茶金花湖南省重点实验室，湖南益阳 413000）

宫颈癌是一种发病率极高的女性肿瘤疾病。每年全球约有55.51 万人患宫颈癌，其中超过50%的人因治疗无效而死亡[1]。在我国，每年因宫颈癌而死亡的人数多达5 万人，约占全球宫颈癌死亡人数的1/6[2]。因环境等因素的影响，宫颈癌发病率持续走高，患病人群日趋年轻化[3]。因此，对宫颈癌疾病的预防、治疗仍然是一项非常艰巨的任务。

茯茶素是茯砖茶中新发现的一类多酚衍生物，已有文献表明其具有广泛的生物活性，包括抑菌、抗氧化、减肥以及抗癌活性[4]。罗珍美等[5]以茯砖茶为原料，利用丙酮、石油醚、三氯甲烷、正丁醇等有机试剂萃取，随后分别通过硅胶、聚酰胺、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、反相硅胶以及小孔树脂（MCI）等多种层析方法对茯砖茶正丁醇萃取部分进行分离纯化，制备得到茯茶素B，其分子式为C13H15O6，分子量266.09，结构如图1 所示。

图1 茯茶素B 的结构图

1 材料与方法

1.1 细胞来源

人宫颈癌细胞Hela 由中国科学院广州生物医药与健康研究院陈小平教授馈赠。

1.2 试剂与仪器

LDZX-75KBS 立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LED1152 倒置显微镜，德国徕卡公司；E191IR 二氧化碳培养箱，美国SIM 公司；DT5-2B 低速离心机，北京新时代北利医疗器械有限公司；Multiskan GO 酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LightCycler 480 实时荧光定量PCR，瑞士Roche公司。

DMEM 基础培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Cell Counting Kit-8、血球计数板、台盼蓝染液、TBST 缓冲液、胰酶、无菌PBS、脱脂牛奶、生理盐水，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；顺铂，德州德药制药有限公司；超敏ECL 化学发光试剂盒、蛋白酶抑制剂、RIPA 裂解缓冲液，上海源叶生物科技有限公司；BCA 试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；RNA Fast 200 总RNA 极速抽提试剂盒，上海飞捷生物技术有限公司；HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、SYBR Green PCR Master Mix（2×），南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SDS-PAGE，北京普利莱基因技术有限公司；PLK1 Rabbit mAb（A21082）、HRP Goat Anti-rabbit IgG（AS014）、ECL 检测试剂盒，武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 材料预处理

茯砖茶由黑茶金花湖南省重点实验室制得，以茯砖茶为原料提取茯茶素B 按照文献报道进行[5]。DF-10 培养基：在DMEM 基础培养基中加入终浓度为10%的FBS、终浓度为100 U/mL 的青霉素以及终浓度为0.1 mg/mL 的链霉素。

1.3.2 Hela 细胞毒性检测

抑制肿瘤细胞异常增殖是评价抗癌药物疗效的重要指标[6]，因而可以通过探究茯茶素B 溶液对宫颈癌细胞增殖的影响来判断其是否有可能够成为治疗宫颈癌的药物。Hela 细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，培养液为DF-10 完全培养基。待Hela 细胞生长至对数生长期，消化细胞并调整浓度为1.0×105cells/mL，按每孔0.1 mL 接种到96 孔培养板中，设置无细胞的空白对照。采用CCK-8 试剂盒检测茯茶素B对Hela细胞活性的影响，按照试剂盒说明书操作。茯茶素B 终浓度分别为0 μg/mL（只加生理盐水，作为阴性对照）、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL和300 μg/mL。每组3个复孔。将培养板在培养箱孵育2 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，混匀后培养2 h。用酶标仪测定450 nm 吸光度，按公式（1）计算细胞活力。

式中，Ai为50 ～300 μg/mL 茯茶素B处理组吸光度值，A0为空白对照组吸光度值，Ab为阴性对照组吸光度值。

1.3.3 Hela 细胞增殖能力检测

取35 mm 培养皿，每皿接种2 mL 浓度为1×105cells/mL 的HeLa 细胞。置于细胞培养箱中预培养24 h，细胞完全贴壁。分别加入终浓度为40 μg/mL顺铂（阳性对照），终浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL 的茯茶素B（实验组），以及生理盐水（阴性对照）。各组设置9 个重复。继续培养24 h、48 h、72 h 后，各组分别取3 皿细胞消化并用血球计数板计数。具体操作：吸弃上清，无菌PBS洗一遍，加入200 μL 胰酶，37 ℃消化8 min。加入300 μL DF-10 终止消化，吹打为单细胞后全部转移至1.5 mL 无菌EP 管，取20 μL 细胞悬液加入等体积0.45%的台盼蓝染液进行染色，最后吸取10 μL 染色的细胞悬液至干净血球计数板中进行计数。

1.3.4 PLK1 mRNA 水平检测

细胞总RNA 提取按照试剂盒说明书进行。取200 ng RNA 按照HiScript III All-in-one RT SuperMix说明书合成cDNA。用12 ng cDNA 为qPCR 反应模板，引物序列如表（1）所示。反应体系25 μL，包括2×SYBR MasterMix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 模板（12 ng/μL）1 μL，DEPC 水8 μL。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s 及60 ℃，40 s 反应40 个循环；溶解曲线95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR 引物体系

1.3.5 PLK1 蛋白表达检测

取对数生长期的Hela 细胞，用不同浓度茯茶素B（0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）处理48 h。RIPA 裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂按照100 ∶1 的体积比混合，在冰上裂解30 min，以12 000 r/min 离心10 min，获得细胞总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质样品通过SDS-PAGE分离后转膜，再用新鲜的5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h。将膜与一抗（PLK1 Rabbit mAb，A21082）在1 ∶2 000 稀释比例下4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜5 次，每次8 min，室温下进行二抗（HRP Goat Antirabbit IgG，AS014）孵育，稀释度为1∶10 000，孵育2 h。采用ECL 检测试剂盒进行显影，内参为β-actin。

1.4 数据分析

数据分析均采用GraphPad Prism 8.0.2 进行处理，所有结果以平均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），PLK1 表达水平与肿瘤抑制率相关性采用Spearman 法分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 茯茶素B 对Hela 细胞活性的影响

如图2 所示，宫颈癌细胞的活性随着茯茶素B 浓度的增加而逐渐减小，即抑癌作用随着茯茶素B 浓度的增强而不断增加，呈现出一定的量-效关系。对宫颈癌细胞活性抑制作用最强的茯茶素B 浓度为300 μg/mL，若继续提高药物浓度，对癌细胞的作用效果可能更强，但药物负荷过高可能对机体肝肾功能产生损害[7]。因此，茯茶素B 对抑制肿瘤生长的最佳浓度需要通过动物实验来加以优化。

图2 茯茶素B 浓度对Hela 细胞活性的影响

2.2 茯茶素B 对Hela 细胞增殖的影响

由图3 可知，未加药物的空白对照组Hela 细胞数随培养时间延长而不断增多，可以排除细胞自身原因造成的假抑制现象。而经茯茶素B 作用过后的宫颈癌细胞个数与加药时间呈负相关：随着作用时间的延长，Hela 细胞个数不断减少，即细胞受到药物的抑制作用越强烈。

图3 茯茶素B 加药时间对Hela 细胞增殖的影响

为了探讨茯茶素B 抑制宫颈癌细胞增殖可能的机制，对不同浓度茯茶素B 处理的Hela 细胞提取总RNA和总蛋白。根据前期的文献，Polo样激酶1（PLK1）是调控细胞周期的一个关键激酶，也是很多抗癌药物的作用靶点之一，因此对茯茶素B 处理前后癌细胞中PLK1 的mRNA（图4）和蛋白相对表达水平（图5）进行了分析。结果显示：茯茶素B 能够抑制Hela 细胞中PLK1 的mRNA 和蛋白表达，并且这种下调作用均呈现出浓度依赖性。

图4 茯茶素B 对Hela 细胞PLK1 mRNA 表达水平的影响

图5 茯茶素B 对Hela 细胞PLK1 蛋白表达水平的影响

为了直接分析茯茶素抑制效力与PLK1 蛋白表达量之间的相关性，对其进行相关性分析，显示茯茶素B 对Hela 细胞的抑制率与癌细胞中PLK1 表达水平呈显著的负相关，如图6 所示。因此，茯茶素B 很可能通过下调细胞周期蛋白PLK1 的表达从而限制癌细胞的扩增，但详细的分子机制以及调控通路还有待未来深入研究。

图6 茯茶素B 对Hela 细胞抑制率与PLK1 蛋白表达水平相关性分析

3 结论与展望

3.1 结论

茯茶素B 对宫颈癌细胞的抑制作用具有明显的量-效关系和时-效关系，且茯茶素B 能够以剂量依赖的方式下调Hela 细胞中PLK1 的蛋白表达水平，这可能是其抑制肿瘤增殖的一种作用途径，但具体的机制还有待阐明。

3.2 展望

当前放疗、手术以及化疗仍然是癌症中最为常见的几种治疗手段[8]。但是在治疗过程中，化疗药物对肿瘤细胞的针对性作用较弱，对正常细胞也会产生一定的伤害。化疗药物在使用过程中，还会产生许多的副作用，对人体的伤害比较大。紫杉醇、长春新碱等一系列天然抗肿瘤药物在临床医学中的广泛应用，极大地刺激了广大学者对这一领域的研究兴趣[9]。这也使得对天然抗肿瘤药物的寻找与研究变得更加深入。本文从黑茶的健康功效出发，针对茯砖茶中分离的天然化合物功能开展研究，初步证实茯茶素B 对宫颈癌细胞具有抑制作用。利用茯茶素B 作为治疗宫颈癌等恶性肿瘤的辅助用药，不仅易于获得，而且使用安全、毒副作用小，将茯茶素B 开发成抗肿瘤的药物具有较好的前景[10]。