基于网络药理学和分子对接的芪黄通秘软胶囊治疗便秘的作用机制研究Δ

金政森,翟弋焱,郭思宇,高艺菲,陶晓宇,张景媛,张繁芹,陆 珊,赵若琪,吴嘉瑞(北京中医药大学中药学院,北京 100029)

便秘是指在多种致病因素的作用下,结直肠、肛门结构和功能发生改变的一种疾病,症状表现为排粪次数减少、排粪量少、粪便干硬,且有排粪不尽感[1]。我国成年人慢性便秘患病率为10.9%[2],且人群便秘患病率逐年升高[3]。短期内,促胃肠动力药物等西医疗法能起到一定效果,但不良反应较多,停药后便秘易复发,而中医治疗便秘在安全性及长期治疗方面具有显著优势[4]。中医治疗便秘有较为悠久的历史,便秘最早记载于清代沈金鳌所著的《杂病源流犀烛》[5],认为便秘主要是由饮食所伤、外感邪气、情志不畅等原因引起,病位在大肠。芪黄通秘软胶囊方中以黄芪、当归为君药,补脾肺之气,滋阴养血,润肠通便;以大黄、肉苁蓉、何首乌、黑芝麻、核桃仁、桃仁和决明子为臣药,泻热通肠,滋阴润燥;以枳实、苦杏仁为佐药,消积导滞,下气通便;大黄兼作使药,取其泻热通肠、凉血解毒、推陈致新之功,适用于便秘辨证属虚秘者,有补气、润肠、促排便的作用。网络药理学是人工智能和大数据时代的新兴学科,强调从生物网络的宏观角度出发,探究药物与疾病之间的关联网络,阐释整体作用机制,交叉性、前沿性强[6];该研究方法通过构建成分-靶点网络,能在一定程度上解释药物各成分与相关靶点的复杂作用关系,特别适用于解释中医药治疗疾病“多成分、多靶点、多通路”的复杂作用机制[4,7]。本研究采用网络药理学方法结合分子对接技术,探讨芪黄通秘软胶囊治疗便秘的科学内涵,为深入开展芪黄通秘软胶囊临床相关研究及应用提供参考和借鉴。

1 资料与方法

1.1 芪黄通秘软胶囊化学成分的检索

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)应用系统药理学技术,给出了《中华人民共和国药典》(2010年版)收录的大部分中草药的分子结构、ADME参数及作用靶点等重要信息[8]。本研究依托TCMSP、TCM Database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/)检索黄芪、何首乌、当归、肉苁蓉、黑芝麻、核桃仁、大黄、决明子、枳实、苦杏仁和桃仁等11味中药的化学成分。

1.2 化学成分的筛选及其靶点的预测

在TCMSP数据库中,以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准进行筛选并预测其靶点;部分化学成分来自TCM Database@Taiwan,将其2D结构上传至SwissTargetPrediction网站(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行筛选,将筛选所得化学成分上传至PharmMapper网站(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)预测其靶点。

1.3 便秘相关靶点的筛选

便秘相关靶点来自DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),以关键词“constipation”检索上述2个数据库中全部靶点,合并后为便秘相关靶点。

1.4 成分-靶点网络的构建

将药物信息与疾病信息导入Cytoscape3.9.1软件(https://cytoscape.org/),构建“成分-靶点”网络,并进行网络分析。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建

将所得化学成分靶点与疾病靶点取交集,将交集靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/),选择打分值≥0.9的高置信区间进行PPI分析,隐藏游离节点。

1.6 核心靶点的筛选

将所得PPI网络导入Cytoscape 3.9.1软件,利用CytoHubba分析靶点网络,以度值、介数中心性、紧密中心度为标准筛选核心靶点。

1.7 基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对筛选出来的核心靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析,并通过R软件进行结果可视化。

1.8 分子对接

根据Cytoscape网络找出与核心靶点对应的化学成分,小分子受体的SDF文件来自PubChem数据库,利用Chem3D软件将SDF文件转化成PDB文件,配体PDB文件来自PDB数据库,将PDB结构导入AutoDockTools 1.5.7软件。对于配体分子,设置可旋转的键及活动键时需要移动的最少的原子数目;对于受体分子,增加经验电荷,加H,合并非共享电子对,合并非极性H,并导出受体、配体PDBQT格式文件,计算其结合能。利用PyMol软件进行结果可视化。一般来说,结合能<-20.92 kJ/mol,说明受体与配体具有较好结合活性,对接效果好,结合能<-29.29 kJ/mol,表明两者之间有强烈的对接活性[9]。

2 结果

2.1 芪黄通秘软胶囊化学成分的筛选及靶点的预测

通过TCMSP数据库共筛选出117个活性成分,15个来自大黄,4个来自核桃仁,7个来自黑芝麻,20个来自黄芪,14个来自决明子,19个来自苦杏仁,6个来自肉苁蓉,23个来自桃仁,22个来自枳实,其中有12个共有化学成分;通过Swiss Target Prediction网站筛选,共得到7个何首乌化学成分。经预测,共得到102个活性成分对应的359个化合物靶点,并将其转换为对应的基因名,有15个成分未预测到其靶点。疾病靶点共112个。

2.2 芪黄通秘软胶囊成分-靶点网络的构建

芪黄通秘软胶囊“成分-靶点”网络见图1。图1中,橙色菱形节点代表化合物分子,青色矩形节点代表药物靶点,度值越大,节点形状越大、颜色越深。成分与靶点之间平均度值为4.2,其中蛋白激酶B(Akt)1、肿瘤蛋白p53(TP53)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP9),雌激素受体(ESR1)与其他10个以上化合物有相互作用关系,槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、刺芒柄花素(formononetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、异鼠李素(isorhamnetin)和柚皮素(naringenin)等33个化合物可以与20个以上的靶点相互作用,并且均具有较高的介数中心性和紧密中心度,提示芪黄通秘软胶囊中多成分、多靶点的药理学共同作用机制。5个靶点中,Akt1和TP53的度值为17。33个化合物中,槲皮素的度值最高,可与151个靶点相互作用;其次为山柰酚,与62个靶点有相互作用关系。

图1 芪黄通秘软胶囊成分-靶点网络图Fig 1 Diagram of “component-target” network of Qihuang Tongmi soft capsules

2.3 芪黄通秘软胶囊靶点PPI网络的构建

359个药物靶点与112成分靶点相交,得到48个交集靶点。利用STRING数据库构建了芪黄通秘软胶囊潜在靶点的PPI网络图,见图2。PPI网络图中共包括42个节点和104条边,节点表示相关蛋白,边表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系,蛋白颜色越深,度值越高,其在网络图中越重要。度值排序居前5位的蛋白分别为Akt1、TP53、EGFR、MMP9、ESR1,与成分-靶点网络分析结果一致。此外,氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、信号转导子和转录激活子1(STAT1)、酪氨酸激酶受2(ERBB2)和细胞周期素D1 (CCND1)等蛋白均具有较高的度值、介数中心性和紧密中心度,在网络中具有枢纽作用。

图2 芪黄通秘软胶囊PPI网络图Fig 2 PPI network diagram of Qihuang Tongmi soft capsules

2.4 GO功能富集分析

依托DAVID数据库对PPI网络及成分-靶点网络中的68个靶点进行GO功能富集分析,共得到414个条目,根据FDR<0.01确定了102个条目,表1根据FDR值列出了部分GO条目及基本信息,图3展示了GO功能富集分析部分结果。102个条目中,有55个条目涉及生物过程,主要集中在正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、信号传导(signal transduction)和蛋白磷酸化(protein phosphorylation)等条目上;31个条目涉及分子功能,主要集中在蛋白结合(protein binding)、锌离子结合(zinc ion binding)和蛋白激活酶活性(protein kinase activity)等条目上;16个条目涉及细胞组分,主要集中在质膜(plasma membrane)、大分子复合物(macromolecular complex)和染色质(chromatin)等条目上,提示芪黄通秘软胶囊可能通过影响以上功能达到治疗便秘的目的。

表1 芪黄通秘软胶囊中部分GO功能基本信息Tab 1 Basic information of partial GO function in Qihuang Tongmi soft capsules

图3 GO富集分析图Fig 3 GO enrichment analysis diagram

2.5 KEGG通路富集分析

依托DAVID数据库对PPI网络及成分-靶点网络中的68个靶点进行KEGG通路富集分析,共得到115个通路,根据FDR<0.01确定了73个通路,表2根据FDR值列出了部分KEGG通路及基本信息,图4展示了KEGG通路富集分析部分结果。115个通路中主要集中在内分泌耐药(Endocrine resistance)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路(MAPK signaling pathway)等通路上。

图4 KEGG富集分析图Fig 4 KEGG enrichment analysis diagram

2.6 分子对接结果

使用AutoDockTools 1.5.7软件对关键靶点受体及其对应的小分子配体化合物进行分子对接预测,并可视化展示,分子对接结果见图5。

A.山柰酚与Akt1(结合能为-25.52 kJ/mol);B.槲皮素与CCND1(结合能为-38.49 kJ/mol);C.木犀草素与ERBB2(结合能为-38.07 kJ/mol);D.鞣花酸与ESR1(结合能为-34.31 kJ/mol);E. 川陈皮素与PPARG(结合能为-30.54 kJ/mol);F.山柰酚与STAT1(结合能为-26.78 kJ/mol)。A.kaempferol and Akt1 (with the binding energy is -25.52 kJ/mol); B.quercetin and CCND1 (with the binding energy is -38.49 kJ/mol); C.luteolin and ERBB2 (with the binding energy is -38.07 kJ/mol); D.ellagic and ESR1 (with the binding energy is -34.31 kJ/mol); E.nobiletin and PPARG (with the binding energy is -30.54 kJ/mol); F.kaempferol and STAT1 (with the binding energy is -26.78 kJ/mol).图5 核心成分分子对接图Fig 5 Molecular docking diagram of core component

3 讨论

本研究采用网络药理学方法结合分子对接技术,探讨了芪黄通秘软胶囊治疗便秘的作用机制。在明确了芪黄通秘软胶囊中化学成分及其作用靶点的基础上,构建了成分-靶点网络,分析了化合物、靶点与疾病之间的复杂相互作用关系,解释了芪黄通秘软胶囊治疗便秘“多成分、多靶点、多通路”的复杂作用机制。

槲皮素、山柰酚、木犀草素和柚皮素均属于黄酮类化合物,来源较为广泛,一般具有抗氧化、抗炎、抗感染和抗肿瘤等诸多作用。现代药理学研究结果指出,槲皮素对心血管疾病、糖尿病和肿瘤等病程较缓的疾病有着较好的防治作用,并能通过促进肠道功能恢复、保护肠黏膜、调节肠道水分等起到治疗便秘的作用[10-11];有学者筛选分析了中药治疗便秘的临床干预文献并结合网络药理学研究方法,发现槲皮素、山柰酚等化合物是治疗便秘的关键成分[12]。其他研究结果也表明,槲皮素、山柰酚、木犀草素和柚皮素等化合物在其他中药复方中均是治疗便秘的关键成分[13-14]。

Akt1属于AGC激酶家族中的成员[15]。研究结果显示,Akt1可与棉子低聚糖强结合达到治疗便秘的效果,其过程主要涉及炎症、免疫和抗氧化[16]。较多研究结果表明,方剂益气开秘汤,中药黄芪、肉苁蓉中的化学成分均能通过与Akt1的结合达到治疗便秘的效果[14,17-18]。PPARG是一种配体激活的转录因子,属于核受体超家族,具有抗炎、参与调节脂肪细胞分化及影响动脉粥样硬化形成等功能[19]。有研究结果指出,刺激PPARα可增加PDZK1的表达,有可能恢复炎症诱导的肠黏膜上皮损伤并改善其吸收功能[20]。同时有证据表明,PPARG、Akt1也是葛根芩连汤用于溃疡性结肠炎治疗的关键靶点[21]。ESR1是一种编码雌激素受体α的基因,是一个庞大的基因,具有复杂的内在(染色质环境、转录因子和信号通路)和外在(肿瘤微环境、分泌因子)机制,受多种调控元件的调控[22]。对山楂的一项网络药理学研究结果显示,山楂作用于MTOR、ESR1和PPARG等靶点,可减少肠道炎症反应,增加肠道运动,减少便秘[23]。STAT1是7个转录因子家族(STAT1、2、3、4、5a、5b和6)的成员,能调节先天和适应性免疫、细胞生长等多种生物事件[24]。有研究结果表明,炮制后的大戟可以通过下调STAT1减轻肠道炎症引起的损伤[25]。

一项基于数据挖掘和网络药理学的研究结果表明,陈皮、木香等芳香中药可作用于内分泌耐药通路,达到治疗便秘的目的[26]。有研究结果指出,MAPK信号通路可改变屏障功能和内脏超敏反应,从而改善肠易激综合征伴随便秘的症状[27]。内分泌耐药通路和MAPK信号通路均是芪黄通秘软胶囊活性成分发挥作用的重要通路。

对于芪黄通秘软胶囊的临床研究,有学者采用随机、双盲双模拟、阳性药平行多对照的多中心研究方法,对223例患者服用芪黄通秘软胶囊的疗效和安全性进行评价,有效率>80%且期间未发生不良反应[28]。有研究结果表明,芪黄通秘软胶囊可以改善5项便秘症状指标和8项中医证候指标,总有效率为92.3%[29]。对284例患者的临床观察发现,采用芪黄通秘软胶囊治疗后,治疗组患者便秘症状的愈显率和有效率均高于对照组,且两组患者均未发生不良反应[30]。有学者采用开放、多中心设计,分析2 400例功能性便秘患者服用芪黄通秘软胶囊后的症状改善情况,治疗21 d后总有效率为98.8%;54例不良事件中,仅6例被判为不良反应,不良反应发生率为0.2%,且均为轻度胃肠道不良反应[31]。以上研究结果提示,芪黄通秘软胶囊在临床上应用是安全、有效的,不良反应发生率低且均为轻微胃肠道不适。

综上所述,本研究采用网络药理学方法和分子对接技术,在系统层面上揭示了芪黄通秘软胶囊治疗便秘的复杂作用机制,为深入开展芪黄通秘软胶囊临床相关研究及应用提供了参考和借鉴。