高产3-甲基丁醛乳酸乳球菌对切达干酪风味的影响

陈 臣，田同辉，周文雅，于海燕，袁海彬，田怀香

（上海应用技术大学香料香精化妆品学部 上海 201418）

切达干酪是一种内部成熟的硬质干酪[1]，是目前世界上消费量最大的干酪品种，同时也是我国进口最多的干酪品种[2-3]。因其含有大量的酪蛋白和多种人体必需氨基酸、维生素等营养物质且具有浓郁的坚果风味而受到大众的广泛欢迎[4-6]。

风味是影响消费者对干酪喜好程度的重要因素[7]。对干酪生产商而言，根据消费者的喜好，关注他们对于干酪的质量和风味的需求至关重要[8]。附属发酵剂是可应用于干酪生产并能够提高干酪风味品质的一类微生物[9-10]，是干酪成熟过程中风味形成的主要贡献者[1]。不同附属发酵剂菌株对干酪的风味影响也有所差异。Drake 等[11]将瑞士乳杆菌WSU19 作为附属发酵剂添加到低脂切达干酪中，其橡木香气与坚果香气强度相较于未添加该菌株的干酪样品更高而苦味较低。宋云花等[12]研究发现，添加附属发酵剂菌株——嗜热链球菌H069-B-01 后切达干酪的水果风味强度有所增加。选择合适的附属发酵剂菌株，研究其对切达干酪风味的影响，对干酪风味改良具有重要意义。

虽然气相色谱-质谱联用技术（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）常用于香气物质检测，但是存在一定的局限性，例如对于一些含量低的香气活性物质检测能力有限，且无法直观地区分样品间的差异。此外，样品的预处理及检测时间限制了该技术的应用[13]。基于此，一些新兴技术，例如气相色谱-离子迁移谱（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）和电子鼻等已逐步应用于食品风味的检测[14]。GCIMS 无需对样品进行预处理且操作简单、检测速度快、灵敏度高[15]，已在多种食品的风味检测中证明了该技术的高效性[16-17]。电子鼻通过模仿人类嗅觉感知达到识别并分类样品中挥发性化合物的目的，能够实现对样品的快速检测[18]。GC-MS、GCIMS 与电子鼻技术相结合可综合各技术的优点，从而达到快速、准确区分样品间差异的目的[19-20]。

3-甲基丁醛在是切达干酪中提供坚果风味的关键香气化合物之一[5]。本实验室前期筛选出1 株在氨基酸培养基中具有高产3-甲基丁醛能力的乳酸乳球菌YN2-1（以下简称YN2-1）[21]。本研究将YN2-1 作为附属发酵剂制备切达干酪，首先采用感官定量描述分析对干酪样品进行评价，使用GC-MS 检测添加YN2-1 的切达干酪及未添加该菌的干酪中3-甲基丁醛含量，而后用GC-IMS 检测各干酪样品中的挥发性风味化合物，最后采用电子鼻技术对不同切达干酪样品进行区分及验证，并结合判别因子分析（Discriminant factor analysis，DFA），解析干酪样品间挥发性组分的差异，探究乳酸乳球菌YN2-1 对切达干酪风味的影响，为开发更适合我国消费者口味的原制切达干酪，促进我国干酪产业发展提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜牛乳，光明乳业有限公司；发酵剂M14，法国丹尼斯克有限公司；凝乳酶MT2200，美国国际香精香料公司；乳酸乳球菌YN2-1，筛选自中国云南的乳扇酸乳清，已证实其具有高产3-甲基丁醛的能力以及良好的耐盐性和耐酸性，现保存于上海应用技术大学产香菌种质资源库；内标物2-辛醇（20 mg/L）、标准品3-甲基丁醛（色谱纯）及正构烷烃（C6～C30，色谱纯），美国Sigma-Aldrich Chemical 公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪（GC-MS 7890-5975），美国Agilent 科技有限公司；Flavour Spec气相色谱-离子迁移色谱联用仪，德国G.A.S 公司；HERACLES II 快速气相色谱型电子鼻，法国Alpha MOS 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国Supelco 公司；DC1741 型干酪小型制备机，上海承欢轻工机械有限公司；PT-20C 型微型杀菌机，上海沃迪智能装备股份有限公司；EMS-10S 型恒温水浴锅，常州市人和仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 附属发酵剂的制备 将乳酸乳球菌YN2-1在脱脂乳培养基中连续3 次传代活化后离心（5 000 r/min，4 ℃，10 min），去除上清液，菌泥用灭菌生理盐水洗涤并离心（5 000 r/min，4 ℃，10 min）2 次。随后，用灭菌生理盐水调整菌液浓度为1.0×109CFU/mL，置于4 ℃冰箱保藏待用（为保证菌体存活率，菌液准备过程与牛乳接菌发酵步骤紧密衔接）。

1.3.2 切达干酪的制备 取生鲜牛乳150 L，灌入杀菌机进行巴氏杀菌（75 ℃，15 s）。将巴氏杀菌后的牛乳冷却至31 ℃后导入干酪罐中，加入发酵剂M14（1%，质量分数）及附属发酵剂（菌液浓度1×109CFU/mL，加入量0.8%，体积分数），30 ℃熟化30 min，待牛乳pH 值下降约0.4 时加入凝乳酶MT2200（1.5%，质量分数）进行凝乳，该过程持续40 min 后切割凝乳，然后以1 ℃/5 min 的升温速率将牛乳温度升至38 ℃，达到预定温度后排乳清操作，在此过程中温度始终保持38 ℃。随着酸度的上升，凝乳凝结成块，将其切割成边长30 cm 的方块，堆酿处理，每隔15 min 翻转1 次。将堆叠的凝乳块切成1 cm3的方块，均匀地将食盐（2.5%，质量分数）撒到凝乳块上，翻拌均匀后入模型压榨成型，真空包装，于10 ℃冰箱中成熟（该温度有利于加快干酪的成熟）[22-24]。分别在成熟0，60 d 和120 d 时取样，样品编号为YN 0 d、YN 60 d、YN 120 d。以不添加附属发酵剂且成熟相同时间的切达干酪为对照组，编号为KB 0 d、KB 60 d、KB 120 d。

1.3.3 感官评价 采用定量描述感官评价法对切达干酪样品进行感官分析。评价小组由12 名成员组成，包括6 名男性和6 名女性成员，平均年龄24 岁。感官评价在标准感官实验室进行。试验前依据ISO 4121 标准对所有评价人员进行专业感官培训。分别取6 个切达干酪样品各20 g 于棕色不透明玻璃瓶中，60 ℃水浴加热30 min，用3 位随机数字编码后以随机顺序呈递给感官评价人员进行感官品评。结合已有的研究基础[7，25]以及感官评价人员的感官描述，经感官小组成员讨论后筛选本实验所用切达干酪样品的10 个感官描述词及其相应的香气参考物（见表1），并要求感官评价人员对切达干酪样品香气的喜好度进行打分。评价结果采用9 分制（1 分：极微弱/极讨厌；3 分：弱/比较讨厌；5 分：中等/既不讨厌也不喜欢；7 分：强/比较喜欢；9 分：极强/极喜欢）。每个样品重复评价3 次，记录每位评价人员的评分结果，最后取平均值即香气强度值。

表1 感官评价描述词及其定义或相应参考物Table 1 Sensory evaluation descriptors and their definitions or corresponding references

1.3.4 气相色谱-质谱联用分析 采用顶空固相微萃取结合气-质谱联用的方法分析不同切达干酪样品中的香气成分。称取3.0 g 研碎的干酪样品于20 mL 顶空瓶中，加入内标物（2-辛醇，20 mg/L）100 μL。用聚四氟乙烯硅胶垫密封后于60 ℃水浴条件下平衡5 min，将萃取头（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS）插入顶空瓶中萃取30 min，等待进样。

色谱柱采用 HP-Innowax（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气，流速1 mL/min。升温程序：在40 ℃下保持4 min，以3 ℃/min 升至100 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至150 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。进样口温度250 ℃。MS条件：电子轰击离子源，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，四级杆温度150 ℃。扫描模式为全扫描，质量扫描范围m/z 30～450。各样品均做3 次平行测定。

定性、定量分析：通过与NIST17 谱库比较，同时根据相同色谱条件下C6～C30 正构烷烃的保留时间计算检测物质的保留指数（RI），并与文献[26]报道的RI 值进行比对定性。通过建立不少于5 点的标准曲线（y=1.96x+0.0883，R2=0.99）对3-甲基丁醛进行定量。

1.3.5 气相离子迁移色谱分析 分别称取3.0 g切碎的切达干酪样品，置于20 mL 顶空进样瓶中，密封，以500 r/min 的孵化转速在60 ℃条件下孵育10 min，然后，通过1 mL 气密加热注射器（85℃）将100 μL 顶空气体自动注入进气口。色谱柱型号为MTX-5（柱长15 m，内径0.53 mm，膜厚1.0 μm，美国RESTEK 公司），柱温60 ℃，载气为氮气（纯度≥99.999%）。流量程序设定：初始流速2 mL/min，保持2 min，然后在18 min 内流速线性升至100 mL/min，并保持在100 mL/min，直至30 min 止。IMS 温度45 ℃，漂移气体的流速150 mL/min。对每个样品做3 次平行分析。

1.3.6 电子鼻分析 称取切达干酪样品各3.0 g，装入20 mL 顶空进样瓶中，置于电子鼻样品盘，待测。测定条件：采用顶空自动进样，进样量5 000 μL，注射速度125 μL/s，孵育温度70 ℃，孵育时间30 min，捕集阱捕集温度50 ℃，捕集时间50 s，分流10 mL/min，柱温箱初始炉温50 ℃，等温线250℃，检测器温度260 ℃，增益12，偏移量1 000。每个样品做3 次平行测定。

1.4 数据处理

使用LAV 软件（laboratory analytical viewer 2.2.1）、Reporter 插件、Gallery Plot 插件和Dynamic PCA 插件以及GC×IMS Library Search 处理GCIMS 数据，采用电子鼻内置程序（Winmuster，version 1.6.2）进行电子鼻数据处理与分析，数据用IBM SPSS Statistics 21.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），用Duncan's 多重比较评定样品间的差异性，当P<0.05 时具有显著性差异。采用Origin Pro 9.0 对试验数据作图。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

采用定量描述感官评价法对不同切达干酪样品的10 种香气及喜好度进行评价，感官评价结果的雷达图如图1 所示。不同切达干酪样品在喜好度、整体香、奶香味、坚果味、肉汤味、硫味以及酸味属性上的香气强度均存在显著性差异（P<0.05）。香气喜好度和整体香气强度最高的两个切达干酪样品为YN 60 d 和YN 120 d，表明添加乳酸乳球菌YN2-1 作为附属发酵剂可提高人们对切达干酪的喜爱程度。其中成熟120 d 的添加YN2-1 菌株的切达干酪的坚果味和肉汤味显著高于其它干酪样品，成熟60 d 的添加YN2-1 的样品的坚果味香气强度超过未添加附属发酵剂的成熟120 d 的样品，表明YN2-1 菌株可在切达干酪成熟过程中产生较多具有坚果味香气的挥发性化合物。与不添加附属发酵剂YN2-1 的切达干酪相比，添加附属发酵剂的3 个成熟度的干酪样品的奶香味均高于前者。此外，随成熟时间的延长，切达干酪的硫味更加明显。两个成熟120 d 的切达干酪样品的硫味均高于其它组别，这可能是导致感官评价员对YN 120 d 样品的喜好程度次于YN 60 d 的原因之一。综上所述，添加YN2-1 的样品的坚果味、奶香味、肉汤味香气强度均高于对照组，同时其喜好度得分也较高，表明乳酸乳球菌YN2-1 对切达干酪中优良香气的提升效果明显。

图1 不同切达干酪样品的感官评价雷达图Fig.1 Sensory evaluation radar chart of different cheddar cheese samples

2.2 GC-MS 分析结果

为探究添加YN2-1 菌株对切达干酪中3-甲基丁醛含量的影响，采用GC-MS 分析不同切达干酪样品中的3-甲基丁醛，确定3-甲基丁醛在不同切达干酪样品中的含量，结果见表2。其中KB 0 d和YN 0 d 2 个样干酪品未经发酵和成熟，干酪中的3-甲基丁醛尚未由氨基酸转化而成或含量极低，从而导致3-甲基丁醛未达到仪器的检出限。根据检测结果，成熟60 d 时添加YN2-1 的样品（YN 60 d）中3-甲基丁醛含量是未添加该菌株样品（KB 60 d）的3 倍以上，这表明添加YN2-1 菌株可有效提高切达干酪中3-甲基丁醛含量。3-甲基丁醛通常在成熟干酪中贡献坚果香气或巧克力香气[27]，该结果可以解释图1 中样品YN 60 d 的坚果风味香气强度得分较高的原因。由于醛类化合物在干酪中随成熟时间的延长而转化为醇类以及相应的酸类[3]，因此在KB 120 d 中未检出3-甲基丁醛，这也是YN 120 d 中3-甲基丁醛含量低于YN 60 d 的原因，此研究结果与切达奶酪相关研究报道[3，27]一致。

表2 不同切达干酪样品中3-甲基丁醛含量Table 2 3-Methylbutyraldehyde content in different cheddar cheese samples

2.3 GC-IMS 分析结果

2.3.1 不同切达干酪样品的气相离子迁移谱图分析 为探究添加YN2-1 对切达奶酪中除3-甲基丁醛外的其它挥发性风味化合物的影响，采用GC-IMS 对不同奶酪样品进行风味分析。不同切达干酪样品中挥发性化合物的GC-IMS 三维谱图见图2a，不同切达干酪样品中的挥发性化合物种类和峰值强度均有所不同。为比较不同干酪样品间的差异，结合二维俯视对比图来分析样品间的挥发性化合物见图2b，以成熟0 d 的未添加附属发酵剂干酪作参比，若某物质的浓度高于参比样品，则为红色，颜色越深该物质含量越高；低于参比，则为蓝色；颜色越深该物质含量低于参比样品越多。在相同成熟时间条件下，添加附属发酵剂——乳酸乳球菌YN2-1 的切达干酪中部分挥发性化合物的含量高于未添加YN2-1 的干酪。随着成熟时间的延长，干酪中挥发性化合物的种类及含量也有所变化，其中成熟120 d 的添加YN2-1 菌株的切达干酪挥发性化合物的种类最多且含量最高。

图2 不同切达干酪样品中挥发性有机物的GC-IMS 三维谱图（a）及二维（b）对比图Fig.2 GC-IMS 3D（a）spectra and 2D（b）comparison of volatile organic compounds in different cheddar cheese samples

2.3.2 不同切达干酪样品挥发性化合物分析 采用IMS 数据库和GC×IMS Library Search 内置的NIST 数据库，根据保留时间、离子迁移时间和保留指数对不同切达干酪样品中挥发性化合物进行分析。在6 个干酪样品中共检出挥发性化合物62种（含二聚体），其中酮类物质15 种、醛类物质11种、醇类物质12 种、酸类物质5 种、酯类物质9种、吡嗪类物质3 种、含硫化合物2 种、未知物质5 种。通过不同切达干酪样品中挥发性化合物的指纹图谱分析（图3）可直观呈现各挥发性化合物在不同样品中的差异（颜色越深、越红，该物质的含量越高）。结合表3 和图3 分析，发现在添加YN2-1 的干酪样品中检测到的挥发性化合物种类多，且随成熟时间的延长各样品中挥发性化合物的种类也增加，同时其含量也有所变化。此外，不同成熟时间的YN2-1 干酪与空白对照组的挥发性化合物均存在显著差异，成熟60 d 和120 d 时差异尤为明显。

图3 不同切达干酪样品种挥发性物质的GC-IMS 指纹图谱Fig.3 GC-IMS fingerprints of volatile compounds in different cheddar cheese samples

在成熟60 d 时，在添加YN2-1 菌株的切达干酪中3-甲基丁醛含量显著高于对照样品，表明YN2-1 菌株在切达干酪中产3-甲基丁醛能力强，同时验证了2.2 节中GC-MS 的检测结果。此外，YN 60 d 中的2，3-丁二酮、丁醛M、2-甲基丁醛、正戊醛、正丙醇、正庚醇、3-甲基丁酸、乙酸丁酯等物质的含量较成熟0 d 时增加明显，且显著高于成熟60 d 的未添加附属发酵剂干酪。在这些显著增加的物质中，2，3-丁二酮主要由柠檬酸进一步代谢形成，具有奶香味[28-29]；2-甲基丁醛的香气贡献同3-甲基丁醛类似，主要由氨基酸代谢形成，赋予切达干酪以可可和坚果类香气[6]；乙酸丁酯主要来源于成熟过程中发生的酯化反应，可使切达干酪具有类似梨子味的水果香气[29]。3-甲基丁酸来源于异戊醇或异戊醛的氧化，有一定的异味，然而干酪中含有的正丙醇可以抑制酸类物质所带来的汗味属性，从而使干酪的香气更加柔和[30]。

当切达干酪样品成熟120 d 时，添加YN2-1组和空白对照组中的挥发性化合物均发生较大的变化。在成熟120 d 的添加YN2-1 菌株的干酪样品中3-甲基丁醛含量虽较成熟60 d 的有所下降，但仍显著高于对照组。由于醛类的化学性质较为活泼，随干酪成熟时间的增加易被还原成醇和相应的酸[31]，因此YN 120 d 样品中2-甲基丁醛、3-甲基丁醛的含量较YN 60 d 中的含量有所降低。在YN 120 d 样品中，检测到含量较高的丙烯酸乙酯、丁酸丁酯、庚酸乙酯、2，5-二甲基吡嗪、2-乙烷基-3，5-二甲基吡嗪、3-甲基-1-丁醇、2-壬酮、2-辛酮，而在其它样品中上述挥发性化合物含量极低。其中的酯类物质主要是由酯化反应或酯交换反应产生，因具有较低的气味阈值而在干酪中类似果香和花香的风味贡献较大[32]。吡嗪类来源于美拉德反应和微生物代谢，是干酪中的重要风味物质，具有典型的坚果类、烘烤类香气[33]，加之YN 120 d 中同时含有坚果香气的3-甲基丁醛等支链醛，因此在前期感官评价中样品的坚果风味属性得分较高。除上述特征物质外，相较于作为对照组的KB 120 d 样品，YN 120 d 中的糠醇D、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、异丁酸、二甲基二硫、正戊醛的含量更高，其中的丁酸、异丁酸被认为是天然切达干酪中重要的风味贡献者[34-35]。

2.4 电子鼻分析结果

为了验证感官评价、GC-MS 及GC-IMS 分析结果，直观体现不同样品间的气味差异，将成熟0，60，120 d 的添加YN2-1 菌株切达干酪及其空白对照组干酪进行电子鼻分析。Heracles II 快速气相型电子鼻是一种新型电子气味分析仪器，结合了快速气相色谱技术的优点，其原理是通过两根极性不同的色谱柱MXT-5 和MXT-1701 对气味进行分离，并通过Arochembase 数据库分析，具有快捷简便、重复性好等优点[36-38]。3 个成熟度条件下，添加YN2-1 菌株的切达干酪样品在大多数出峰位置的峰面积大于未添加YN2-1 菌株的干酪（图4），表明添加YN2-1 菌株的干酪样品的多数香气物质含量及香气强度高于未添加组，再次证明添加乳酸乳球菌YN2-1 对切达干酪的多种挥发性香气成分的含量具有一定的提升作用。

图4 不同切达干酪样品电子鼻雷达图Fig.4 Electronic nose radar chart of different cheddar cheese samples

为进一步区分不同切达干酪样品，且在缩小组内误差的基础上更好地体现样品间的差异，对电子鼻数据进行判别因子分析（见图5）。判别因子分析是判定个体所属类别的统计分析方法，它通过两个或多个已知类别的样本数据优化区分，在主成分分析法的基础上使组间距离最大的同时保证组内差异最小[39-40]。如图5 所示，6 个切达干酪样品分布区域不重叠且分布间隔较大，在第1判别因子轴上不同成熟时间切达干酪样品得到有效区分，同时添加YN2-1 菌株干酪与空白对照组在第2 判别因子轴上区分明显，与电子鼻雷达图结果一致。电子鼻分析表明：将YN2-1 作为切达干酪的辅助发酵剂，可显著影响切达干酪的香气表现，验证了感官评价、GC-MS 及GC-IMS 的分析结果。

图5 不同切达干酪样品的判别因子分析图Fig.5 DFA chart of different cheddar cheese samples

3 结论

采用GC-MS、GC-IMS 及电子鼻技术探究切达干酪中添加乳酸乳球菌YN2-1 作为附属发酵剂对其风味的影响。结果表明，添加YN2-1 的切达干酪样品与对照组的香气品质、风味物质种类及含量均有显著差异。YN2-1 菌株作为附属发酵剂，可显著提高干酪中3-甲基丁醛含量，增强坚果风味，并使干酪的消费者喜好度提高。此外，YN2-1 对于成熟60 d 或120 d 的切达干酪中2，3-丁二酮、2-戊酮D、2-壬酮、2-甲基丁醛、正丙醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2，5-二甲基吡嗪、2-乙烷基-3，5-二甲基吡嗪等风味物质的产生以及奶香、果香风味的增强也有作用。综上所述，乳酸乳球菌YN2-1 具有较好的应用潜力，适于开发适合中国消费者口味的干酪产品。