基于没食子酸-花色苷指示膜的制备及其在基围虾鲜度指示中的应用

焦文娟，黄华丹，叶铠雯，刘琳，费永涛，张业辉，赵甜甜，刘伟峰，陈帅，周芳，张友胜

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）（2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东广州 510642）（3.仲恺农业工程学院轻工与食品学院，广东广州 510225）

食品新鲜度是消费者判定食品质量和安全的一个可靠指标，能够反应食品的质量、顾客的接受度及食用安全性。随着社会经济的快速发展、人们消费观的转变，人们对食品的鲜度要求越来越高。因此，新鲜度的检测尤为重要，快速无损的鲜度可视化的智能包装受到广泛关注[1]。

食品鲜度指示膜是智能包装的一种，通过颜色的变化指示原料的新鲜度，实现对食品原料鲜度的检测及实时监控。鲜度指示膜由颜色指示剂和成膜基质两个部分组成，目前用于智能指示膜的比色指示剂主要是合成的，包括甲基红、溴甲酚紫等化学染料[2]。由于合成化学染料具有毒性，会对人体健康产生一定的危害[3]，因此，开发具有天然安全无毒的指示剂显得尤为重要。花色苷是一种无毒无害的天然水溶性色素，主要结构会随着pH值的变化而变化，从而呈现不同的颜色[4]，可以满足鲜度指示膜指示剂的要求。目前，天然色素作为指示剂也成为了国内外研究的热点之一。Zhai等[5]采用玫瑰茄花色苷作为指示剂，用于指示鱼肉的新鲜度变化，指示膜颜色由红变为浅蓝色。Ma等[6]研发了PVA-壳聚糖纳米颗粒-桑椹提取物薄膜用于实时监测鱼的腐败，发现颜色由红变绿色。

花色苷作为天然色素已经在鲜度指示膜进行广泛应用，但单一的天然色素存在一定的局限性，比如花色苷的性质不稳定、易受外界环境的影响，如何提升花色苷的稳定性受到广泛关注。将花色苷与辅色剂复合使用是常见的提高花色苷稳定性的方法之一，没食子酸作为常用的辅色剂，已在果酒或果汁中进行花色苷的辅色应用[7]。因此，本研究选择花色苷与没食子酸进行复配制备鲜度指示膜，以期提高花色苷的稳定性以及增加花色苷在不同pH值范围内的显色差异，以没食子酸来补充花色苷的变色局限范围，为鲜度指示膜的实际应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓花色苷（5%～25%）、聚乙烯醇（1788型、0588低粘度型）、丙三醇（分析纯），购于罗恩试剂；明胶，食品级，购于河南万邦实业有限公司；没食子酸，购于上海源叶生物科技有限公司；磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸、氧化镁，分析纯，购于天津市大茂化学试剂厂；磷酸二氢钠，分析纯，购于天津市永大化学试剂有限公司；硼酸，分析纯，购于福晨（天津）化学试剂有限公司；甲基红，分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；溴甲酚绿，分析纯，购于上海化学试剂总厂；基围虾，购于广州盒马鲜生。

1.2 仪器与设备

EUROSTAR 60 digital顶置式搅拌器，德国IKA公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；PB-10 pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；JJ1000电子天平，常熟市双态测试仪器厂；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计，日本SHIMADZU公司；OHG101-3B电热恒温干燥箱，上海喆钛机械制造有限公司；FYL-YS-50LK恒温箱，北京福意联电器公司；VERTEX 70傅立叶变换红外光谱，德国Bruker公司；S-3400扫描电子显微镜，Hitachi高新技术有限公司；L＆W厚度仪，瑞典Lorentzen＆Wettre公司；INSTRON 5566电子万能材料试验机，美国INSTRON公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪，丹麦福斯（FOSS）集团公司。

1.3 方法

1.3.1 指示膜的制备

称取0.6 g明胶，加入5 mL丙三醇以及80 mL去离子水，在85 ℃条件下搅拌加热30 min，然后加入5.4 g低粘度型聚乙烯醇和高粘度型聚乙烯醇，在100 ℃条件下搅拌加热2 h，期间补足水分。

将上述制成的混合溶液于35 ℃的水中搅拌30 min至其冷却，加入25 mL花色苷+没食子酸混合溶液，在35 ℃条件下搅拌交联1 h。之后，使用针筒吸取15 mL膜液至于培养皿（直径90 mm）中，在35 ℃烘箱中干燥48 h。以此方法制备3种不同比例的指示膜（m花色苷:m没食子酸=1:0.7、1:0.5、1:0.3）。揭膜后置于相对湿度为50%、温度为25 ℃的恒温恒湿中平衡48 h后测定性能。

1.3.2 紫外-可见光光谱的测定

制备不同pH梯度的磷酸盐缓冲溶液（pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）。制备质量浓度为2.5 g/L的花色苷溶液和没食子酸混合溶液，分别取1 mL花色苷溶液以及1 mL花色苷溶液+0.7、0.5、0.3 mL没食子酸溶液至10 mL血清瓶中，添加不同pH值梯度的磷酸盐缓冲溶液至10 mL，混合均匀后使用UV-1800紫外-可见分光光度计进行可见光光谱扫描，波长范围为400～800 nm[8]。

1.3.3 傅立叶变换红外光谱的测定

采用傅立叶变换红外光谱仪分别测定明胶膜、聚乙烯醇膜、明胶聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+没食子酸膜7种膜的红外吸收光谱，波数范围设置为3500～500 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.4 微观结构的测定

将明胶膜、聚乙烯醇膜、明胶聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+没食子酸膜用锋利刀片切成2 mm×1 mm的薄片，经液氮冻裂，真空溅射喷金后，使用Hitachi（日立）S-3400扫描电子显微镜观察膜横截面的微观形貌，加速电压为5 kV。

1.3.5 厚度和机械性能的测定

将制备好的7种膜（明胶膜、聚乙烯醇膜、明胶聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+没食子酸膜）在恒温恒湿室内（25 ℃，50% RH）放置3 d，然后进行厚度和机械性能的测定。

膜的厚度采用L＆W micrometer 250测定。在待测膜上随机取5个点测定，取平均值。膜的机械性能使用INSTRON testing machine 5566测定，参照GB/T 1040.3-2006的方法[9]，使用电动冲片机将膜裁剪成哑铃型，有效测试长度和宽度为12 mm×2 mm，拉伸速度设定为100 mm/min，测量膜的抗拉强度（Tensile Strength，TS）和断裂伸长率（Elongation at the Break，EB），每种膜作5个平行，取均值。

1.3.6 指示膜在监测基围虾鲜度的初步应用

购买新鲜的基围虾，取可食用部分备用。将花色苷膜和不同比例混合复合膜，粘贴在一次性饭盒的盒盖上，指示膜与基围虾不直接接触。每个饭盒放20 g虾肉，盖上盒盖，贴上保鲜膜，于室温下放置48 h，并根据GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[10]要求，每隔12 h测定一次挥发性盐基氮。

1.3.7 指示膜的色差分析

对于用于指示基围虾贮藏过程中的鲜度指示膜进行色差分析，利用色差仪根据CIE-L*a*b*颜色系统，测定膜的明暗度（L*）、红绿度（a*）、黄蓝度（b*）。以标准白板为色差参比，并按以下公式（1）计算总色差（ΔE）。

式中：

ΔL＝L*-L0*；

Δa＝a*-a0*；

Δb＝b*-b0*；

L*、a*、b*——待测样品的实测值；

L0*、a0*、b0*——标准白板的值。

1.4 数据处理及分析方法

实验结果表示为平均值±标准差，使用Origin 21软件和SPSS软件Duncan’s进行图表绘制和方差分析，P＜0.05时表明存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见光谱和颜色变化分析

图1和图2是四种溶液在不同pH值环境下的颜色变化和紫外-可见光谱图。如图1a所示，随着溶液的pH值由2.0增加到11.0，花色苷溶液由红色逐渐变为棕黄色，当在pH值2.0～3.0酸性条件下，花色苷结构转化为黄烊阳离子，溶液呈现红色；当在pH值4.0～6.0条件时，颜色逐渐变浅，因为黄烊阳离子被水亲核攻击而水合，花色苷结构从黄烊阳离子转化为无色的甲醇假碱和查尔酮；当在pH值7.0～9.0条件时，溶液颜色呈褐色；当pH值增至11.0时，花色苷被降解，溶液颜色逐渐转为黄棕色[11,12]。从图2a可知，不同pH值条件下花色苷溶液的最大吸收峰波长也有差异，在pH值2.0～3.0条件下，最大吸收峰波长为512 nm；当pH值增至8.0时，最大吸收峰变为570 nm；当pH值从9.0增加到11.0时，最大吸收峰为563 nm。花色苷溶液的颜色变化和吸收峰的移动与花色苷自身结构转变有关，在酸性条件下，512 nm处的最大吸收峰是由于花色苷黄烊阳离子的存在；在碱性条件下，花色黄烊阳离子与羟基离子共同作用形成无色的甲醇假碱和查尔酮，随着pH值的增加，最大吸收峰波长移动到563 nm处[11-13]。

图1 在pH值2.0～11.0缓冲溶液的颜色变化Fig.1 Color change of buffer solutions in the pH range of 2.0～11.0

图2 溶液的紫外-可见光谱Fig.2 UV-Vis spectra of solution

由图1和2所示，花色苷溶液与没食子酸溶液按比例（m花色苷:m没食子酸=1:0.7、1:0.5、1:0.3）混合，随着溶液的pH值由2.0增加至11.0，混合溶液的颜色变化很明显。当pH值≤6.0时，混合溶液的颜色由亮红色逐渐变为浅红色；当pH值为7.0时，溶液呈浅棕色；当pH值为8.0时，溶液呈灰色；当pH值9.0时，溶液呈灰蓝色；在pH值10.0～11.0时，溶液由深绿色向黄绿色转变。与花色苷溶液相比，在pH值2.0～3.0时的最大吸收峰值差别不大，但在pH值8.0时，不同比例混合溶液的最大吸收峰值在596 nm左右，且最大吸收峰随着pH值增大而增强，在pH值11.0时，不同比例混合溶液的最大吸收峰为601 nm。红移现象以及吸光度的增加都说明了花色苷和没食子酸之间存在相互作用，且加入没食子酸后，混合溶液在不同pH值条件下呈现的色调更丰富，颜色差异有显著的提升[14]。添加没食子酸能够使花色苷在不同的pH值条件下呈现更多的颜色变化，能够提升花色苷作为pH值敏感指示剂的潜在应用价值。

3.2 傅立叶红外光谱分析

图3是7种膜的红外光谱图。分别分析明胶膜、聚乙烯醇膜、明胶聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+没食子酸膜共7种膜的傅立叶红外光谱，以更深入地了解花色苷、没食子酸和明胶以及聚乙烯醇之间的化学相互作用。如图3所示，聚乙烯醇膜的红外光谱图中，3292 cm-1处为-OH的伸缩振动吸收峰，2918 cm-1处为-CH2的伸缩振动吸收峰，1421、1373、1083 cm-1处分别为-CH2变形振动吸收峰、-OH的变形振动吸收峰以及C-O的伸缩振动吸收峰[15]。在明胶膜的红外吸收光谱图中，在3292、3075、1630、1539和1236 cm-1处的特征峰分别是由-OH的伸缩振动、N-H的伸缩振动和蛋白质的酰胺Ⅰ带、Ⅱ带、Ⅲ带峰引起的[16]。在明胶聚乙烯醇膜的红外光谱图中，与明胶膜和聚乙烯醇膜比较发现，共混后在3292 cm-1处的-OH伸缩振动吸收峰变宽而强，以及在2918 cm-1处的-CH2的伸缩振动吸收峰变尖，说明了明胶和聚乙烯醇直接存在强烈的氢键作用[17]。共混膜的蛋白质酰胺Ⅰ带、Ⅱ带、Ⅲ带峰分别蓝移至1718、1654、1245 cm-1处，进一步证明明胶和聚乙烯醇存在相互作用。加入花色苷后，没有新峰产生，说明没有新的共价键生成，特征峰的位置和明胶聚乙烯醇膜的相差不大，说明花色苷与明胶聚乙烯醇膜相容性很好，其化学成分没有受到明胶和聚乙烯醇的影响，且在1654 cm-1和1556 cm-1处，添加花色苷的特征吸收峰有明显的增强，是由花色苷中芳香环骨架上的C=C键振动引起，表明其与成膜基质存在分子间相互作用[18]。在加入没食子酸的复合膜的红外光谱图中，同样没有新峰产生，说明没有新的共价键形成，且峰的位置与花色苷膜的峰的位置差别不大，对比花色苷膜，在1556 cm-1和1253 cm-1处，添加了没食子酸的膜在这两处特征吸收峰变浅，这两处是芳香环骨架上的C=C键振动[19]和酚类物质的-OH键面内弯曲振动引起[20]，这表明了没食子酸可以和花色苷很好的结合，其化学成分没有受到影响。

图3 明胶、聚乙烯醇、明胶聚乙烯醇膜及复合膜的红外光谱Fig.3 FT-IR spectra of gelatin, polyvinyl alcohol, gelatin- polyvinyl alcohol and composite films

3.3 膜的颜色

颜色是指示膜的一个重要特征指标，通过L*、a*、b*和ΔE值对膜的颜色响应进行评价，L*表示颜色的明度从暗到亮，a*表示颜色由红（+）到绿（-），b*表示颜色由黄（+）到蓝（-）。如表1所示，相比于花青素膜，不同没食子酸比例复合膜的L*和ΔE值显著增大（P＜0.05），a*值显著降低（P＜0.05），复合膜的“绿色”增强、亮度增加，表现出明显的颜色变化，这可能是由于助色剂（没食子酸）与花青素之间的相互作用导致的[7]。对于三种不同没食子酸含量的复合膜而言，复合膜（1:0.5）的L*值呈现最大值（95.87），而a*和b*值呈现最小值，分别为-7.14和6.94。复合膜（1:0.5）的ΔE值最大（96.39），随着没食子酸含量的继续增加（1:0.7），反而降低了指示膜的色差值，这可能是由于过量没食子酸的原因。

表1 不同指示膜的颜色Table 1 Color of the different indicates films

3.4 指示膜的微观结构分析

采用电子扫描电镜对明胶膜、聚乙烯醇膜、明胶聚乙烯醇膜、花色苷膜和不同比例的花色苷+没食子酸膜共7种膜横截面微观结构观察。如图4所示，明胶膜的横截面光滑，从而也可以看出明胶具有脆性断裂的特点。聚乙烯醇膜的横截面可以看出存在与韧性断裂变形的区域。共混后的明胶聚乙烯醇膜的微观结构发生变化，横截面存在一些颗粒，但比较均匀，没有显著的相分离现象，说明明胶和聚乙烯醇具有良好的相容性。加入花色苷后，复合膜的横截面出现一些微孔，这可能膜液自身存在气泡而导致，因为多酚能够与蛋白作用而增强其起泡性[21,22]。加入没食子酸后，复合膜的横截面相比花色苷膜光滑很多，可以看见多酚均匀分布在膜表面，填补了一些微孔，使复合膜的致密性增加。但当没食子酸的含量增加到m花色苷:m没食子酸=1:0.7时，复合膜上的絮凝物增加，也更粗糙，推测可能是多酚的含量过高而引起蛋白聚集[23]。

图4 膜横截面的扫描电镜Fig.4 Scanning electron micrographs of cross sections of films

3.5 厚度和机械性能分析

膜的力学性能与成膜基材密切相关。如表2所示，明胶和聚乙烯醇共混后的复合膜厚度有显著增加（P＜0.05），花色苷和没食子酸的加入也对指示膜的厚度有所影响。加入花色苷之后，膜的厚度有一定的减少，可能是花色苷与明胶和聚乙烯醇产生了分子间的相互作用，从而导致厚度有一定程度的减少。添加没食子酸作为花色苷的辅色剂后，膜的厚度随没食子酸添加量的增加而增加，可能是没食子酸降低了分子间的相互作用，使得分子间距离增大，导致膜的厚度增加[24]。

表2 7种膜的厚度及机械性能Table 2 Thicknesses and mechanical properties of seven films

评价包装材料性能的还有两个重要指标，就是抗拉强度和断裂伸长率，膜的机械性能受结晶结构和分子间作用力的影响[25]。明胶与聚乙烯醇共混后，膜的抗拉强度显著降低（P＜0.05），而加入花色苷后有小幅度的增加（P＜0.05），但再加入没食子酸后有所下降。拉伸强度主要与膜的内部结构和分子间氢键作用力有关，花色苷的加入有利于氢键形成，膜的抗拉伸强度更高，但加入没食子酸与花色苷相互作用形成辅色复合体后，分子内相互作用减弱，从而导致抗拉伸强度有一定幅度的降低[26]。而明胶和聚乙烯醇共混后，断裂伸长率有极大的提升，高达1234.30%。加入花色苷和没食子酸后，断裂伸长率虽然有所降低，但都在1000%～1200%之间，明显高于邹小波等[27]以淀粉、壳聚糖和聚乙烯醇作为成膜基底材料制备的指示膜（88.16%），而降低的原因可能是花色苷和没食子酸占据了更多的空隙位点，减少了水分与明胶和聚乙烯醇间的交联[28]。

3.6 鲜度指示膜在基围虾新鲜度检测的初步应用分析

图5是基围虾在不同时间的挥发性盐基氮和pH值变化图。鱼虾等肉类腐败变质时，伴随着蛋白质的降解，以及挥发性盐基氮的产生，同时导致贮藏环境pH值的上升，从而使鲜度指示膜的颜色发生改变[29]。由图5可知，随着放置时间的延长，虾肉中的TVB-N含量和pH值不断上升。TVB-N初始值为1.13 mg/100 g，36 h后的TVB-N含量升高至22.8 mg/100 g，48 h后TVB-N含量高达41.53 mg/100 g。根据GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》[30]的规定，虾类的消费限值是20 mg/100 g，所以基围虾在室温放置大约32 h（18.80 mg/100g ）后便不能继续销售以及食用。基围虾的初始pH值为6.83，经过12 h的贮藏达到7.22，经过48 h的贮藏为7.84。

图5 基围虾挥发性盐基氮（TVB-N）和pH值的变化Fig.5 Changes of volatile base nitrogen (TVB-N) and pH in basal shrimps

花色苷膜及不同比例的复合膜在12、24、36 h和48 h时间的颜色及色差ΔE如表3所示，最开始指示膜的颜色是深灰色，24 h后，花色苷膜呈淡黄色，添加了没食子酸的膜呈淡褐色，此时虾肉开始腐蚀，散发出腐臭味。36 h时，花色苷膜的颜色变为淡黄色，添加了没食子酸的膜呈深绿色，此时虾肉已经不能食用。48 h时，虾肉高度腐败，花色苷膜颜色为棕黄色，添加了没食子酸的膜呈金黄色。花色苷膜及不同比例的复合膜在24～48 h内ΔE的变化呈现显著性差异（P＜0.05），但添加没食子酸的复合膜的颜色变化更易被肉眼感知和区别，能更加清晰地反映了基围虾的鲜度变化。因此，添加没食子酸的复合膜用于基围虾的新鲜度指示效果更好。

表3 指示膜的ΔE及外观颜色变化Table 3 The ΔE and color change of the indicates films

3 结论

没食子酸的加入能够拓宽花色苷在不同pH值条件下的显色丰富度，且花色苷和没食子酸与成膜基质的相容性很好。加入花色苷之后，膜的厚度有一定的减少，随着没食子酸含量的增加，膜的厚度逐渐增加。没食子酸的添加导致抗压强度降低，加入花色苷和没食子酸后，断裂伸长率虽然有所降低，但都在1000%～1200%之间，添加少量的没食子酸能够使复合膜的横截面相对光滑（m/m，1:0.3和1:0.5）。将指示膜用于基围虾的鲜度指示，随着时间的推移，基围虾逐渐腐败变质，添加没食子酸的复合膜颜色变化更明显（由灰色变成黄色），指示效果好。研究结果表明花色苷和没食子酸是智能指示膜的理想指示原料，可用于开发指示水产品新鲜度的智能包装，为进一步开发可视化鲜度指示膜奠定基础，具有良好的应用潜力。