多指标正交试验法优选经典名方一贯煎的提取工艺研究

李亚楠,李争,廖明丽△,李菲,李军山,2

（1.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 051430;2.云南神威施普瑞药业有限公司,云南 楚雄 675099）

经典名方一贯煎出自清代魏之琇所著《续名医类案》，为滋阴疏肝之良方[1]。清朝钱敏捷《医方絜度》所载一贯煎由沙参、麦冬、当归、枸杞子、生地黄、川楝子6味药物组成，以水煎服。该方配伍严谨，用药精简。古医籍记载一贯煎功效为滋阴疏肝，主治肝肾阴虚，肝气郁滞证，临床上广泛应用于慢性肝病、胃病、干燥综合征、糖尿病、干眼症、耳鸣等证属肝肾阴虚，肝郁气滞者[2-12]。目前对一贯煎的研究多处于基础实验研究和临床研究。作为汤剂，在现代临床应用过程中存在需临用新制、久置易发霉变质、携带不便、服用量大等缺点。且已上市的中成药由于历史和技术的原因，存在工艺数据不充分、不同厂家质量差异较大、临床评价难度大等问题，因此科学地设定工艺参数、保证产品均一稳定、符合传统疗效已经成为经典名方发展的重要问题。

为此，本研究以组方中生地黄活性成分毛蕊花糖苷为指标成分，考察其最优提取工艺，为后期工业化生产提供合理数据支持。为保证临床用药的质量与疗效，须对其制备工艺进行研究。文献[13]显示，在研究水煎煮过程中，水的加入量、提取次数和提取时间是影响提取效率的重要因素，直接影响有效成分在提取物中的溶解效果。为全面考察该方剂的提取效果，使药材有效成分最大程度地发挥临床疗效，本研究基于成熟的含量测定方法，按照L9（34）表进行正交试验。以毛蕊花糖苷含量和干浸膏收率、毛蕊花糖苷含量转移率为考察结果，综合分析各影响因素，确定最优提取工艺。

1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；CPA225D电子分析天平[赛多利斯股份公司（德国）]；KH7200DE型数控超声波清洗器；JJJ1000型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DK-98-ⅡA型水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；Agilent

10.0

10.00 ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱；毛蕊花糖苷对照品购自中国食品药品检定研究院（批号111610-201908）；甲醇、乙腈均为色谱纯（天津科密欧试剂有限公司）；水为纯化水；其他试剂均为色谱纯。中药饮片均购自于河北蔺氏盛泰药业有限公司，经原河北省药品检验所孙宝惠老师鉴定符合《中国药典》2020年版一部项下相关规定[14]。

2 方法

为使制剂最大程度地保留其标准煎剂属性，并使处方中各中药材的有效成分被最大程度的提取，还原其汤剂的临床疗效，经查阅相关资料[15]，处方中的各味药材的有效成分均溶于水，均可用水作为提取溶媒。生地黄作为一贯煎处方中的君药，且毛蕊花糖苷作为地黄中的活性成分，其水溶性较好，自2010年起就收录于药典中[16]。因此本实验将毛蕊花糖苷的含量和干膏率、含量转移率作为考察指标，结合正交试验优选提取条件。

2.1 干膏率的测定 取按正交试验所得的提取液，浓缩成120ml浸膏，移取20ml至已经恒重的干燥蒸发皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，80℃干燥5h，取出，置干燥器中，冷却30min后精密称定，再在上述温度条件下干燥1h，冷却，称定重量，至连续两次称定质量的差异不超过3mg为止，计算干膏得率。

2.2 含量转移率的计算 将按正交试验所得的提取液进行浓缩，干燥后测定干膏粉中毛蕊花糖苷含量，同时测定生地黄饮片中毛蕊花糖苷的含量。结合2.1中各正交试验所得干膏率，计算每组实验所得干膏粉的含量转移率。

计算公式为：毛蕊花糖苷含量转移率=干膏率×各实验干膏粉毛蕊花糖苷含量/饮片毛蕊花糖苷含量。

2.3 毛蕊花糖苷含量测定方法学考察

2.3.1 色谱条件与系统适用性 采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈-0.5%冰醋酸溶液（15∶85）为流动相，检测波长334nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量10μl，理论板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于5000，色谱峰之间分离度良好。

2.3.2 对照品溶液的制备 取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）混合溶液制成每1ml含20μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品色谱图见图1、样品色谱图见图2。

图2 样品中毛蕊花糖苷色谱图

2.3.4 标准曲线的绘制 称取毛蕊花糖苷对照品9.96mg，以乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）混合溶液为溶剂定容置5ml量瓶中。按照2.3.1项下色谱条件，精密吸取12μl、16μl、20μl、24μl、32μl、40μl，分别注入高效液相色谱仪测定峰面积，以毛蕊花糖苷的峰面积积分值为纵坐标（Y）对毛蕊花糖苷的质量（X）作线性回归，绘制标准曲线，得毛蕊花糖苷的标准曲线方程为Y＝147429.61X+3505682.96（r=0.9996）。结果表明，毛蕊花糖苷在23.90-79.68ug之间与峰面积成线性关系，并且效果良好。

2.3.5 重复性试验 分别称取同一正交试验所得干膏粉样品6份，按2.3.3项下供试品处理方法制备供试品溶液，按照2.3.1项下的色谱条件进行进样，记录峰面积，结果显示样品中毛蕊花糖苷含量平均值为4.27%，RSD=1.1，证明方法重复性良好。

2.3.6 精密度试验 将2.3.4中对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，RSD=0.1，说明仪器精密度良好，符合分析要求。

2.3.7 稳定性试验 将同一正交试验所得干膏粉样品按2.3.3项下供试品处理方法制备供试品溶液，按照2.3.1项下的色谱条件进行进样，分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进样，测定样品峰面积。RSD=0.6，结果表明样品中毛蕊花糖苷在24h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验 分别称取同一正交试验所得干膏粉样品6份，各0.5g，分别加入对照品适量，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，测定样品含量，计算平均回收率和RSD。结果表明样品平均回收率为100.04%，RSD＝1.7。

2.4 正交试验 分别将提取时间、加水倍数、提取次数3项作为考察因素，每个因素选择3个水平，其分别为：加水倍数8倍、10倍、12倍；提取时间设定为0.5h、1h、1.5h；提取次数1、2、3次；按照L9（34）表进行正交试验。并对试验数据进行方差分析，筛选一贯煎的最佳提取工艺。正交试验因素水平表见表1，正交试验设计表见表2。

表1 正交试验因素及水平表

表2 正交试验设计表

3 数据处理与分析

3.1 综合指标计算 因本次试验涉及多个指标，参照Hassan法对3个指标进行归一化处理，将3个指标数据进行整合处理，得到一个总评指数，并对总评指数进行分析。总评指数计算公式为：Di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，OD=D1+D2+D3…+Dn/N。

Ymin为组内最小值，Ymax为组内最大值，N为指标数，将各实验所得干膏粉的毛蕊花糖苷含量、干膏率、毛蕊花糖苷含量转移率按照上述公式进行计算，将结果作为最终评价指标进行分析。OD值结果见表3，正交试验分析及结果见表4，方差分析结果见表5。

表4 正交试验分析及结果

表5 方差分析表

根据表5方差分析结果可知，因素的影响大小顺序为：C＞A＞B，即提取次数＞加水量＞提取时间。方差分析得出的最优提取条件应选为：A3B3C2，即按处方量称取一贯煎饮片，加水煎煮2次，每次加12倍水，每次提取1.5小时。经过多重分析及结合实际生产经验，保证干膏率符合一贯煎质量标准的同时，毛蕊花糖苷含量提取1.5小时与提取1小时差异不大，加10倍量水与加12倍量水差异不大。为使提取效果满足预期目标的同时节约生产能源，将提取工艺改为：按处方量称取一贯煎饮片，加水煎煮两次，第一次加饮片量12倍饮用水，加热煎煮1小时，第二次加饮片量10倍量的饮用水，加热煎煮1小时。滤过，合并两次煎液，浓缩，干燥。

4 验证

按照处方量称取一贯煎饮片300kg，均匀分成三份，每份100kg，按上述最优工艺进行三批生产验证。即取100kg一贯煎饮片，加水煎煮两次，第一次加饮片量12倍饮用水，加热煎煮1小时，第二次加饮片量10倍量的饮用水，加热煎煮1小时。滤过，合并两次煎液，浓缩，干燥，所得生产数据见表6。通过三批验证，此工艺生产数据稳定，可以生产出安全、均匀、稳定可靠的产品。

表6 生产数据汇总表

故此工艺可作为经典名方一贯煎在生产上的提取工艺。

5 结论

自2017年3月国家中医药管理局发布《古代经典名方目录制定的遴选规范和遴选原则（征求意见稿）》以来，共100首方剂入选。一贯煎作为传统中药方剂补益剂的代表，也列入此目录。根据相关数据显示，2014年149个获批上市的新药中，中药只有11个，仅占7.38%，2015年获批上市的新药中，中药仅有7个。中医药作为我国历史上独特的文化瑰宝，在市场上具有庞大的空间，而经典名方作为中医药文化中不可或缺的一部分，经过上千年的积累，其疗效确切，应用广泛，具有扎实的临床疗效积累。本研究基于传统一贯煎方剂的处方配伍，以干浸膏出膏率、地黄中毛蕊花糖苷含量及含量转移率为综合考量指标，结合以往生产经验优选出一贯煎工业生产的最优提取工艺，并通过三批生产验证确认工艺的稳定性、可靠性，为一贯煎大批量生产积累了数据和经验，同时也为经典名方的传承与创新贡献力量。但是一贯煎处方中中药材种类较多，仅以单一药材的活性成分作为最终成品的指标成分太过单一，仍需对其含量指标成分的充分性进行深入研究。