lncRNA NEAT1 促进脓毒症诱导肝细胞损伤和炎症反应的机制研究

曹纪玲,孙 坚,吴 勇,胡志青

（1. 南京江北医院重症监护室，江苏 南京 210048；2. 南京江北医院急诊医学，江苏 南京210048；3. 南京江北医院重症医学，江苏 南京 210048）

脓毒症是由感染引起的致命性疾病，可诱发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory reaction syndrome,SIRS）。目前，脓毒症患者的病死率为25%～30%[1-2]，但尚无特异且有效的脓毒症相关肝损伤的治疗干预措施[3]。因此，深入研究脓毒症的发病机制至关重要。

miRNA 是一大类短链非编码RNA 分子，其靶向mRNA 并抑制基因的翻译。miRNA 参与许多生物学过程，包括细胞分化、增殖、凋亡等。脓毒症患者存在miRNA 水平失调或差异性表达[4]。有研究表明，miR-129-5p 可以减轻脓毒症引起的肺损伤[5]。然而，炎症条件下miR-129-5p 是否在脓毒症引起的肝损伤中起关键作用目前尚不清楚。lncRNA 是长度超过200 nt 的非编码RNA，参与多个生物过程。lncRNA 和miRNA 可以相互结合，进一步促进转录后调控。lncRNA 核旁斑组装转录本1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1）在肿瘤发生中发挥关键作用，其过表达与癌症患者的不良预后有关[6]。此外，lncRNA NEAT1 在脓毒症诱导的急性肾损伤患者中明显上调，其上调与脓毒症患者急性肾损伤的严重程度相关[7]。然而，lncRNA NEAT1 在脓毒症引起的肝损伤中的作用仍不清楚。

本研究通过分析lncRNA NEAT1 对miR-129-5p 及其预测的靶基因Toll样受体4（Toll-like receptor 4 gene,TLR4）的调控作用，探讨脓毒症诱导的肝细胞损伤和炎症反应机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集我院重症监护室15 例脓毒症致肝损伤患者的外周血和体检的15例健康者的外周血，分别设为脓毒症组和健康组。根据《赫尔辛基宣言》，本研究经我院医学伦理委员会审批通过（2021046），每个受试者均签署对本研究的知情同意书。

1.2 NCTC1469细胞培养

小鼠正常肝细胞NCTC1469 购于武汉普诺赛生命科学有限公司。将NCTC1469 细胞置于含2 mmol/L 谷氨酰胺的无血清RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司）中，并在37 °C、5%CO2的湿润培养箱中培养。

1.3 细胞转染与分组

NCTC1469 细胞用100 mmol/L 脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）单独刺激24 h，建立体外脓毒症模型，待细胞中炎症因子表达显著上调，表明LPS 诱导的体外模型成功建立，将其设为LPS 组。将未处理的NCTC1469细胞设为对照组。

转染前将NCTC1469细胞接种于12孔板中培养24 h。当细胞融合达70%～90%时，使用Lipofectamine 2000试剂（美国Invitrogen 公司）转染6 h 后，更换培养基培养24 h，收集细胞和细胞上清，用于后续细胞实验。单独转染mimic NC、mimic、inhibitor NC、inhibitor 质粒载体（上海吉玛公司）的NCTC1469细胞分别设为mimic NC组、mimic组、inhibitor NC组、inhibitor组。

另外，当细胞融合达70%～90% 时，使用Lipofectamine 2000 试剂转染6 h 后更换培养基，用100 mmol/L LPS 刺激细胞24 h，或者LPS 联合45 mg/L TLR4重组蛋白（英国Abcam 公司）刺激细胞24 h，收集细胞和细胞上清，用于后续细胞实验。将LPS刺激下转染mimic NC、mimic、siNC、siNEAT1 质粒载体的细胞分别设为LPS+mimic NC 组、LPS+mimic 组、LPS+siNC 组和LPS+siNEAT1 组，将LPS、siNEAT1、TLR4 重组蛋白联合处理的细胞设为LPS+siNEAT1+TLR4 组，将LPS、mimic、TLR4 重组蛋白联合处理的细胞设为LPS+mimic+TLR4组。

1.4 RNA提取和qPCR分析

将健康组、脓毒症组的外周血及处理好的NCTC1469细胞置于冰上，加入TRIzol试剂（美国ThermoFisher 公司）裂解5～10 min，将液体排入EP 离心管，加入1/5 体积的氯仿；液体混合后在4 ℃下放置10～15 min，随后离心15 min；取出400～500 μL上清液并放入新的EP 管中。加入等体积的异丙醇，在4 ℃下孵育10 min，然后以12 000 r/min 离心10 min。所得颗粒用75%乙醇洗涤，干燥后加入50 μL DEPC水完全溶解颗粒，然后于-80 ℃下储存。根据说明书，用TRIzol 试剂提取血液或细胞总RNA。在溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上电泳确认RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT 试剂盒（日本Takara 公司）逆转录1 μg 总RNA。用于扩增的引物序列见表1。GAPDH 用于内参基因。

表1 引物序列

1.5 Western blot

使用RIPA裂解缓冲液制备用于裂解的全细胞裂解物，然后在SDS-PAGE凝胶上分离并转移到PVDF膜上。使用TLR4、GAPDH一抗和适当的辣根过氧化物酶偶联二抗进行蛋白免疫印迹分析，然后用增强的化学发光试剂检测蛋白表达，并使用光密度测定法进行量化。

1.6 ELISA法

NCTC1469 细胞在96 孔板中用含10%FBS 和1%青霉素-链霉素的DMEM培养，以5 000个/孔的密度在37 °C、5%CO2加湿培养箱中培养。收集对数生长期的NCTC1469 细胞及细胞培养上清液，按照ELISA 试剂盒说明书分别检测TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。分离外周血血清后，按照说明书检测外周血中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.7 5'-脱氧朊啶核苷酸末端标记（TdT-mediatedd UTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测细胞凋亡

各组NCTC1469 细胞用PBS 洗涤，然后用4%多聚甲醛固定。实验根据TUNEL 试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）说明书进行。TUNEL 阳性细胞视为凋亡。使用荧光显微镜（德国蔡司Axio Vert A1）获得荧光图像。显微镜下以TUNEL 阳性细胞占总细胞的比例计算细胞凋亡率。

1.8 双荧光素酶报告基因检测

将含预测的miR-129-5p 结合位点或相应突变片段的lncRNA NEAT1/TLR4 基因片段克隆到pGL3 基本载体中。mimic 的寡核苷酸用于miR-129-5p 过表达。在转染过程中，pGL3、miRNAoligos和pRL质粒与Lipofectamine3000（美国ThermoFisherScientific 公司）以1∶3（DNA：Lipofectamine）的比例共转染到NCTC1469 细胞中。转染48 h后，使用测定试剂盒说明书（美国普洛麦格公司）检测海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，计算萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值。

1.9 统计学分析

使用Graph Pad Prism 83.0 进行统计分析。正态分布的数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，LSD-t法分析两两比较的差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA NEAT1、miR-129-5p、TLR4 和炎症因子在脓毒症诱导的肝损伤患者体内的表达

qPCR 结果显示，与健康组相比，脓毒症组外周血中lncRNA NEAT1和TLR4的表达明显升高（P＜0.05），而miR-129-5p的表达明显降低（P＜0.05），见图1a。miR-129-5p表达与lncRNA NEAT1、TLR4 表达均呈负相关（P＜0.05），lncRNA NEAT1 表达与TLR4 表达呈正相关（P＜0.05），见图1b。脓毒症组外周血中TNF-α、IL-6 和IL-1β的表达比健康组分别高1.5、3.0、38.0倍（P＜0.05），且ELISA获得了类似的结果（P＜0.05），见图1c、d。

图1 脓毒症组和健康组外周血中lncRNA NEAT1、miR-129-5p、TLR4及炎症因子的表达

2.2 LPS 刺激下沉默lncRNA NEAT1 对miR-129-5p表达的影响

与对照组比较，LPS 组lncRNA NEAT1 的表达增加，miR-129-5p 的表达减少（P＜0.01）；与LPS 组、LPS+siNC 组比较，LPS+siNEAT1 组中lncRNA NEAT1 的表达降低，miR-129-5p的表达增加（P＜0.01），见图2。

图2 LPS刺激下沉默lncRNA NEAT1对miR-129-5p的影响

2.3 LPS 刺激下lncRNA NEAT1 通过调控TLR4 对肝细胞炎症和凋亡的作用

与对照组比较，LPS+siNC 组中TLR4 mRNA 和蛋白表达水平均上调（P＜0.05）；与LPS+siNC 组比较，LPS+siNEAT1 组中TLR4 mRNA 和蛋白表达水平均下调（P＜0.05）；与LPS+siNEAT1 组比较，LPS+siNEAT1+TLR4 组中TLR4 mRNA 和蛋白表达水平均上调（P＜0.05），见图3a、b。与对照组比较，LPS+siNC 组中细胞凋亡率上调（P＜0.05）；与LPS+siNC 组比较，与LPS+siNEAT1 组中细胞凋亡率下调（P＜0.05）；LPS+siNEAT1 组比较，LPS+siNEAT1+TLR4 组中细胞凋亡率上调（P＜0.05），见图3c。与对照组比较，LPS+siNC 组中TNF- α、IL-6 和IL-1β 的表达均上调（P＜0.05）；与LPS+siNC 组比较，LPS+siNEAT1 组中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表达均下调（P＜0.05）；与LPS+siNEAT1 组比较，LPS+siNEAT1+TLR4 组中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达均上调（P＜0.05），见图3d、e。

图3 LPS通过上调lncRNA NEAT1促进TLR4的表达诱导炎症反应和细胞损伤

2.4 lncRNA NEAT1/miR-129-5p 及miR-129-5p/TLR4的相互作用

经生物信息学软件TargetScan 预测发现，lncRNA NEAT1和miR-129-5p之间存在结合碱基区（图4a）。双荧光素酶基因报告实验测定结果显示，在野生型（NEAT1-WT）中，与mimic NC 组比较，mimic 组的荧光素酶活性降低（P＜0.05）；在突变型（NEAT1-MUT）中，与mimic NC组比较，mimic组的荧光素酶活性变化无统计学意义（P＞0.05），见图4a。miR-129-5p 与lncRNA NEAT1存在相互作用。qPCR分析显示，siNEAT1沉默了lncRNA NEAT1 并增加了miR-129-5p 的表达（P＜0.01），见图4b、c。

图4 lncRNA NEAT1/miR-129-5p及miR-129-5p/TLR4的相互作用

进一步分析miR-129-5p 与TLR4 的相互作用。生物信息学软件TargetScan 预测miR-129-5p 和TLR4 有多个结合位点（图4d）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-129-5p 与TLR4 之间存在靶向关系。mimic明显降低了TLR4野生型（WT）细胞的荧光素酶活性（P＜0.01），而对TLR4 突变型（MUT）细胞的荧光素酶活性无影响（P＞0.05），见图4e。与mimic NC 组比较，mimic组中miR-129-5p的表达增加，TLR4的mRNA和蛋白表达显著下调（P＜0.05）；与inhibitor NC 组比较，inhibitor 组中miR-129-5p 的表达下调，TLR4 的mRNA和蛋白表达上调（P＜0.05），见图4f～h。

2.5 lncRNA NEAT1 通过miR-129-5p 靶向TLR4 调节LPS诱导的炎症反应

qPCR 结果显示，与对照组比较，LPS+mimic NC 组TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA 表达增加（P＜0.05）；与LPS+mimic NC 组比较，LPS+mimic 组TNF-α、IL-6 和IL-1β的mRNA表达降低（P＜0.05）；与LPS+mimic组比较，LPS+mimic+TLR4 组TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA表达增加（P＜0.05），见图5a～c。ELISA 实验所观察到的TNF-α、IL-6 和IL-1β 表达结果与qPCR 的结果相似（P＜0.05）,见图5d～f。因此，TLR4 作为miR-129-5p 的下游效应分子调节LPS 诱导的炎症反应。TUNEL 实验结果显示，与对照组比较，LPS+mimic NC 组的细胞凋亡率增加（P＜0.05）；与LPS+mimic NC 组比较，LPS+mimic 组的细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与LPS+mimic组比较，LPS+mimic+TLR4 组的细胞凋亡率增加（P＜0.05），见图5g。

图5 miR-129-5p表达可诱导炎症反应和细胞损伤

3 讨论

脓毒症是一种全身性炎症反应，严重时可能导致器官功能障碍和/或循环障碍[7]。失调的炎症反应在脓毒症引起的肝损伤中起关键作用[8]。之前的研究证实了多种microRNA 和lncRNA 与炎症反应都有关[9-11]，然而，其在调节脓毒症引起的肝损伤中的具体作用尚未明确。本研究根据TargetScan 软件预测发现，lncRNA NEAT1 与miR-129-5p 之间存在相互作用，这可能与脓毒症患者的严重程度和预后不良有关。此外，本研究观察到脓毒症诱导的肝损伤患者体内的TNF-α、IL-6、IL-1β、lncRNA NEAT1 和TLR4 的表达均增加，但miR-129-5p 的表达水平降低。进一步证明了lncRNA NEAT1 可通过调节miR-129-5p 的表达，靶向TLR4 来调节LPS诱导的炎症反应。这些研究结果为脓毒症引起肝损伤的治疗提供了一个潜在治疗靶点。

研究表明，lncRNA NEAT1 在脓毒症患者体内表达上调，其在脓毒症诱导的急性肾损伤中也扮演着重要角色[12-13]。本研究结果显示，在脓毒症诱导的肝损伤患者中，lncRNA NEAT1 表达也升高，这与之前的研究一致。另外，lncRNA NEAT1 的升高还伴随着miR-129-5p的抑制、TLR4的激活以及炎症反应的显著增加。本研究结果显示，miR-129-5p 与lncRNA NEAT1、TLR4 均呈负相关，而lncRNA NEAT1 与TLR4呈正相关。之前研究也指出，lncRNA NEAT1 可通过与miR-129-5p 的结合，抑制miR-129-5p 的表达从而促进酒精性脂肪肝的肝纤维化[14]。因此，本研究在脓毒症中证实了lncRNA NEAT1、miR-129-5p 和TLR4 在介导脓毒症诱导的肝损伤中具有显著的相关性。

在实验性脓毒症模型中，LPS 通常用于研究脓毒症期间的炎症反应[15-17]。本研究发现，与脓毒症引起肝损伤患者的lncRNA NEAT1表达上调结果一致，LPS刺激后肝细胞中lncRNA NEAT1 的表达上调，而沉默lncRNA NEAT1 则降低了LPS 诱导的炎症细胞因子水平。此外，用TLR4 重组蛋白上调TLR4 的表达可以逆转沉默lncRNA NEAT1 对细胞凋亡和炎症细胞因子表达的抑制作用，这表明miR-129-5p 和TLR4 在lncRNA NEAT1的下游扮演重要角色。

本研究结果还显示，lncRNA NEAT1/miR-129-5p和miR-129-5p/TLR4直接结合，这可能是lncRNA的内源竞争性RNA机制发挥的作用[18-19]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实lncRNA NEAT1与miR-129-5p可直接结合，并且证实TLR4是miR-129-5p的靶基因，TLR4可以被miR-129-5p 靶向抑制。因此，本研究认为在LPS 刺激下，lncRNA NEAT1 的表达显著上调，随后与miR-129-5p 竞争性结合，使细胞中miR-129-5p 的表达显著降低，提示lncRNA NEAT1 扮演了内源竞争性RNA，从而激活被miR-129-5p 抑制的靶基因TLR4，TLR4被激活后刺激下游信号传导，导致严重的炎症反应并诱导肝损伤。

综上，lncRNA NEAT1 在脓毒症引起的肝损伤中具有重要的生物学功能，其在脓毒症诱导的肝损伤患者体内表达上调，且与miR-129-5p 竞争并调节TLR4，以促进肝损伤。揭示了lncRNA NEAT1/miR-129-5p/TLR4轴在脓毒症诱导的肝损伤中的重要功能，为脓毒症诱导的肝损伤提供了潜在的治疗靶点。