miR-524-5p调控HEG1表达对食管癌细胞上皮间质转化的影响

王娅菲，耿天祥，陈林林，李治国，李世朋

0 引言

食管癌（esophageal cancer, EC）是临床上常见的迁移、侵袭能力很强的癌症之一[1]，致病因素包括吸烟、饮酒、社会地位低下、生存环境不佳、微量元素缺乏等[2]。食管癌术后预后较差，化疗是治疗食管癌的主要手段，但长期使用化疗药物会产生耐药性，导致治疗效果不佳。目前，靶向疗法在食管癌的临床治疗中已发挥了重要作用[3]。研究发现miRNA及其靶基因在食管癌中与免疫浸润、肿瘤微环境、癌症干性特性和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）呈现不同程度的相关性[4]。研究表明多种miRNA通过调控其靶基因影响食管癌细胞的迁移、侵袭能力，如miR-493过表达靶向Wnt5a/PD-L1[5]、miR-2053过表达靶向KIF3C[6]等均可抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭，起抑癌作用。Starbase数据库预测显示miR-524-5p与具有EGF样结构域的心脏发育蛋白1（heart development protein with EGFlike domains 1, HEG1）有结合位点。已知HEG1在肝癌细胞中表达上调，并且可以促进肝癌细胞侵袭转移和EMT进程[7-8]。本研究拟探讨miR-524-5p是否通过调节HEG1影响食管癌细胞的增殖、EMT和侵袭转移并对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 细胞

人食管癌细胞TE-1购自上海泽叶生物科技有限公司；人食管癌细胞KYSE30、KYSE150购自上海烜雅生物科技有限公司；人食管癌细胞NEC由上海生化细胞所提供；人正常食管上皮细胞HEEC购自上海研域生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

RPMI 1640培养基购自上海麦克林生化科技有限公司；miR-524-5p过表达（miR-524-5p mimic）或阴性对照（miR-524-5p NC）序列购自上海吉玛制药公司；胎牛血清（FBS）、LipofectamineTM2000转染试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CCK-8试剂盒购自上海宏叶生物科技有限公司；双荧光素酶试剂盒购自上海通蔚实业有限公司；一抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail和二抗均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；HEG1抗体购自美国Invitrogen公司。仪器：CO2恒温培养箱购自德国艾本德公司；荧光倒置显微镜购自徕卡显微系统上海贸易有限公司；PCR仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将1.1中四种人食管癌细胞和人正常食管上皮细胞用RPMI1640培养基（含有10%FBS，青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml），在5%CO2、 37℃培养箱中培养，每2天更换一次培养基，传代培养至对数期用于后续实验。调整培养的5种细胞浓度至每升1×107个，于6孔板每孔接入1 ml上述浓度细胞，培养24 h。

1.3.2 RT-qPCR检测miR-524-5p及HEG1 mRNA表达 收集1.3.1中培养的细胞，加入TRIzol溶液提取总RNA，按照反转录试剂盒进行PCR扩增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，扩增条件为：95℃ 60 s, 95℃ 10 s, 60 ℃ 30 s，共40个循环。miR-524-5p以U6为内参，HEG1以GAPDH为内参。引物设计见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.3 HEG1在食管癌肿瘤组织和正常食管组织中的表达 利用GEPIA数据库查询HEG1在食管癌肿瘤组织和正常食管组织中的表达水平。

1.3.4 细胞转染与分组 KYSE30细胞以2×105个/孔的密度接种6孔板中，37℃恒温CO2培养箱培养过夜后，采用LipofectamineTM2000试剂转染核酸序列，实验分为四组：转染miR-524-5p mimic（miR-524-5p mimic组）、miR-524-5p NC（miR-524-5p NC组）、共转染miR-524-5p NC和pcDNA3.1（miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组）和共转染miR-524-5p NC和pcDNA3.1-HEG1（miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组），另设置未经转染的细胞为正常对照组（Control组）。转染后细胞培养6 h，弃掉培养基，更换为1.3.1中使用的培养基继续培养72 h，收集细胞用于后续实验。

1.3.5 细胞增殖能力检测 使用CCK-8试剂盒检测KYSE30细胞增殖能力，细胞按照1.3.4中的方法转染后，继续培养72 h，分别于24 、48和72 h三个时间段加入CCK-8溶液，培养2 h后，用酶标仪在450 nm下读取吸光度值。

1.3.6 KYSE30细胞克隆形成实验 按照1.3.4的方法转染细胞后，培养24 h后收集KYSE30细胞，重新在培养皿中按照1×103个/皿接种KYSE30细胞，继续培养2周后，弃培养液，PBS冲洗，加入固定液固定15 min，弃去固定液，结晶紫染色，显微镜观察并计数克隆细胞数目。

1.3.7 Western blot检测蛋白表达 将细胞按照1.3.4的方式培养24 h后，收集细胞，裂解后提取总蛋白，测定蛋白浓度。随后进行电泳、转膜及5%脱脂牛奶室温封闭等操作，封闭2 h后加入一抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail、HEG1（1:1 000）培养过夜，PBS清洗后加入二抗（1:2 000）培养2 h，GAPDH（1:1 000）为内参，加入ECL显影，Image J软件分析条带灰度值，计算蛋白表达量。

1.3.8 KYSE30细胞迁移能力检测 细胞划痕实验：将细胞按照1.3.4的方法培养至对数期后，用无菌10 μl移液枪枪头尖在6孔板底部垂直划线，PBS冲洗后加入无血清的RPMI1640培养基，培养24 h，分别在培养的0和24 h时用显微镜观察并拍照，计算划痕愈合率。

1.3.9 KYSE30细胞侵袭能力检测 Transwell实验：将基质胶用不含血清的RPMI 1640培养基稀释8倍后，每个小室加入50 μl，置于CO2恒温培养箱（37℃）培养30 min，将按照1.3.4的方法转染细胞，消化重悬后，在小室的上室中接入200 μl浓度为1×105/ml的细胞悬液，下室为600 μl含血清的RPMI1640培养基，培养24 h后，加入固定液固定，结晶紫染色，擦去上室细胞，倒置显微镜拍照并计数。1.3.10 双荧光素酶报告基因检测 利用Starbase数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-524-5p与HEG1的结合位点，构建野生型（WT）和突变型（MUT）HEG1质粒，利用LipofectamineTM2000试剂将miR-524-5p mimic或NC和HEG1野生或突变质粒共转染KYSE30细胞，并且转染海肾质粒为内参，转染48 h后用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性。

1.4 统计学方法

采用SPSS26.0和GraphPad Prism 9软件进行数据分析。所有数据均表示为平均值±标准差（±s），多组比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-524-5p和HEG1在人食管癌细胞和正常食管上皮细胞中的表达

miR-524-5p在食管癌细胞TE-1、KYSE30、KYSE150、NEC中的表达均显著降低，HEG1 mRNA相对表达量在各细胞系中均显著上调（均P=0.000），见表2。说明在食管癌细胞中miR-524-5p为低表达，HEG1高表达。本实验选择miR-524-5p表达量最低的KYSE30细胞作为后续实验细胞。

表2 miR-524-5p和HEG1在几种食管细胞系中的相对表达量Table 2 Relative expression of miR-524-5p and HEG1 in several esophageal cell lines

2.2 HEG1在食管癌组织和正常食管组织中的表达

在GEPIA数据库中，HEG1在食管癌组织中表达显著高于正常食管组织（P<0.05），见图1。

图1 HEG1在食管癌组织和正常食管组织中的表达Figure 1 Expression of HEG1 in esophageal cancer tissues and normal esophageal tissues

2.3 KYSE30细胞增殖能力

在24、48、72h时，miR-524-5p NC组和Control组的KYSE30细胞增殖能力比较，差异均无统计学意义（均P>0.05），在24 h时，与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组KYSE30细胞增殖能力差异无统计学意义（P>0.05），与m i m i c+p c D N A 3.1 组比较，m i R-5 2 4-5 p mimic+pcDNA3.1-HEG1组KYSE30细胞增殖能力明显增强（P=0.000）；在48 h和72 h时，与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组KYSE30细胞增殖能力明显降低（均P=0.000），与miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组比较，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组KYSE30细胞增殖能力明显增强（均P=0.000），见表3。

表3 miR-524-5p对KYSE30细胞增殖能力的影响Table 3 Effect of miR-524-5p on the proliferative capacity of KYSE30 cells

2.4 KYSE30细胞克隆形成率

miR-524-5p NC组（385.13±17.12）和Control组细胞克隆形成数（387.88±16.04）比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组的KYSE30细胞克隆形成数（143.22±10.85）明显降低（P=0.000），与miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组（152.25±11.34）比较，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组KYSE30细胞克隆形成数（293.10±13.74）明显上升（P=0.000），见图2。

图2 各转染组KYSE30细胞平板克隆形成情况Figure 2 Plate clone formation of KYSE30 cells in each transfection group

2.5 KYSE30细胞中EMT、HEG1和miR-524-5p的表达

miR-524-5p NC组和Control组上皮标志蛋白E-cadherin、间质标志蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail以及HEG1蛋白、miR-524-5p表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组上皮标志蛋白E-cadherin、miR-524-5p表达明显上调，间质标志蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail及HEG1蛋白表达明显下调（均P=0.000），与miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组比较，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组上皮标志蛋白E-cadherin、miR-524-5p表达明显下调，间质标志蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail及HEG1蛋白表达明显上调（均P=0.000），见图3、表4。

图3 不同转染组中EMT相关蛋白和HEG1蛋白表达量Figure 3 EMT-related protein and HEG1 protein expression in different transfection groups

表4 不同转染组中EMT相关蛋白和HEG1蛋白表达量Table 4 EMT-related protein and HEG1 protein expression in different transfection groups

2.6 KYSE30细胞迁移能力

miR-524-5p NC组细胞划痕愈合率（（42.59±2.33）%）和Control组（（43.28±3.51）%）比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组KYSE30细胞划痕愈合率（（21.68±1.65）%）明显降低（P=0.000）；与miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组（（22.15±1.44）%）比较，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组KYSE30细胞划痕愈合率（（34.25±1.65）%）明显升高（P=0.000），见图4。

图4 划痕实验检测各组KYSE30细胞迁移能力Figure 4 Scratch assay of the migration ability of KYSE30 cells in each group

2.7 KYSE30细胞侵袭能力

miR-524-5p NC组（212.48±9.12）和Control组细胞侵袭数目（208.26±7.48）比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组KYSE30细胞侵袭数目（89.35±6.95）明显降低（P=0.000），与miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组（91.02±7.05）比较，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组KYSE30细胞侵袭数目（149.75±8.47）明显升高（P=0.000），见图5。

图5 Transwell实验检测KYSE30细胞侵袭能力Figure 5 Invasion ability of KYSE30 cells detected by Transwell assay

2.8 侵袭迁移相关蛋白MMP2、MMP9表达

miR-524-5p NC组和Control组细胞MMP2、M M P 9 蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与miR-524-5p NC组比较，miR-524-5p mimic组KYSE30细胞侵袭迁移相关蛋白MMP2、MMP9表达明显降低（均P=0.000），与miR-524-5p mimic+pcDNA3.1组比较，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1组KYSE30细胞侵袭迁移相关蛋白MMP2、MMP9表达明显升高（均P=0.000），见图6、表5。

图6 侵袭迁移相关蛋白表达量Figure 6 Expression of invasive- and migration-related proteins

表5 各组KYSE30细胞中侵袭迁移相关蛋白表达量比较Table 5 Comparison of expression levels of invasionand migration-related proteins in KYSE30 cells among all groups

2.9 双荧光素酶报告基因检测结果

miR-524-5p可以靶向结合HEG1的3'UTR区域，见图7。双荧光素酶报告基因实验结果，miR-524-5p mimic组与WT-HEG1共转染组细胞荧光素酶活性显著低于miR-524-5p NC组与WT-HEG1共转染组（P=0.000），miR-524-5p mimic组与MUTHEG1共转染组的细胞荧光素酶活性与miR-524-5p NC组与MUT-HEG1共转染组差异无统计学意义（P>0.05），Control组、miR-524-5p NC组之间与WT-HEG1共转染和与MUT-HEG1共转染差异均无统计学意义（P>0.05），见表6。说明miR-524-5p可与HEG1的3'UTR区结合。

图7 miR-524-5p与HEG1 3'UTR结合位点Figure 7 Binding site of miR-524-5p to HEG1 3 UTR

表6 miR-524-5p靶基因验证Table 6 Validation of miR-524-5p target gene

3 讨论

食管癌是致命性的恶性肿瘤之一，已发现多种miRNA可以通过靶向不同靶标来调节食管癌进展，如miR-33a-5p靶向DKK1抑制食管癌进展[9]；miR-375通过阻断ERBB2/VEGFA通路抑制食管癌发展[10]等。miR-524-5p已被发现对多种肿瘤细胞的耐药性、迁移侵袭、EMT进展有抑制作用[11-13]。但尚未见miR-524-5p对食管癌细胞调节作用的相关性研究报道。本研究中首先通过miR-524-5p在食管癌四种不同细胞系和正常食管上皮细胞中的表达，确定了其在食管癌细胞中呈低表达。随后设置miR-524-5p过表达组探讨miR-524-5p对食管癌细胞增殖、迁移侵袭和EMT进程的影响。结果显示通过过表达miR-524-5p可以显著降低食管癌细胞的增殖能力和克隆形成，与以往研究的上调miR-524-5p可抑制胃癌细胞增殖具有一致性[14]，证明了过表达miR-524-5p可抑制食管癌细胞的增殖。

完整的EMT癌细胞状态主要集中在复发癌组织中[15]。EMT是癌细胞侵袭和转移的根源，其发生过程主要表现为上皮标志蛋白E-cadherin下调，间质标志蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail等上调[16-17]。EMT与恶性肿瘤的迁移、侵袭、化学耐药性相关[18]。因此，抑制癌细胞的EMT进程对于预防恶性肿瘤复发具有重大意义。miRNA可抑制恶性肿瘤的EMT进程，如miR-451抑制胶质瘤细胞的EMT和转移[19]；miRNA-10a-5p抑制肝癌细胞的转移[20]。本研究结果显示，过表达miR-524-5p明显提升了KYSE30细胞的上皮标志蛋白E-cadherin表达水平，下调了间质标志蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail的表达水平，表明过表达miR-524-5p抑制了KYSE30细胞EMT进程。癌细胞转移扩散是癌症患者死亡的主要原因，miR-524-5p过表达已被证明可以抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移[13]。MMP2、MMP9是与癌细胞侵袭和迁移密切相关的蛋白，抑制其表达可有效抑制癌细胞的转移扩散进程[21]。本研究划痕实验和Transwell实验结果均显示过表达miR-524-5p后，KYSE30细胞侵袭迁移能力减弱，且MMP2、MMP9蛋白表达下调，说明miR-524-5p过表达可抑制KYSE30细胞的侵袭迁移。

HEG1是一种新型黏蛋白样膜蛋白，与血管生成、胚胎发育及细胞-细胞连接密切相关，在促进肿瘤进展中发挥着重要作用。已有报道显示，HEG1在恶性间皮瘤[22]、肝细胞癌[7]、肺腺癌[23]中高表达，可作为肿瘤的诊断和治疗靶点。本研究通过GEPIA数据库对HEG1在EC中的表达进行分析发现HEG1在食管癌肿瘤组织中表达水平显著高于正常组织；进一步分析显示，HEG1在四种不同食管癌细胞系中的表达均高于正常食管上皮细胞，提示HEG1可能在食管癌中充当促癌基因。使用Stabase数据库对miR-524-5p的潜在靶基因进行预测，发现HEG1与miR-524-5p存在互补的结合位点，可能为miR-524-5p的下游靶基因。双荧光素酶报告基因检测证实，miR-524-5p可与HEG1的3'UTR区结合；qRT-PCR和Western blot结果显示，过表达miR-524-5p可下调HEG1表达，表明miR-524-5p可负向调控HEG1表达。因此本研究推测，HEG1可能为miR-524-5p调节KYSE30细胞恶性生物学行为的重要靶蛋白。为了验证此推测，本研究在过表达miR-524-5p的基础上采用质粒转染上调HEG1表达，结果显示上调HEG1表达可明显减弱过表达miR-524-5p对KYSE30细胞恶性生物学行为的抑制作用，提示过表达miR-524-5p可能通过下调HEG1抑制KYSE30细胞的增殖、EMT进程和侵袭迁移。

综上所述，miR-524-5p在食管癌细胞和组织中低表达，过表达miR-524-5p可以负向调节HEG1在食管癌细胞系KYSE30细胞中的表达，减轻KYSE30细胞的增殖、EMT进程和侵袭迁移能力。然而本研究仅开展了细胞实验，随后将在动物实验中进行验证，以期明确miR-524-5p在食管癌进展中的作用。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。