杜马斯燃烧法测定奶粉中蛋白质的方法研究

刘琳，高波

（黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨 150028）

0 引 言

奶粉是以哺乳类动物鲜乳为原料[1-3]，添加或不添加营养强化剂，通过特定工艺加工而成的粉状食品。奶粉营养丰富，蛋白质作为其中最主要的营养成分[4-5]，含量高低是评定奶粉品质的重要依据。因此，精准、稳定、快速、高效测定奶粉中蛋白质含量十分重要。

检测蛋白质含量的方法很多[6-14]，凯氏定氮法、比色法、燃烧法[15]应用广泛。但前2 种方法耗时、费力、有污染、不安全[16]，燃烧法测定蛋白质含量所使用的主要仪器为杜马斯定氮仪，分析过程3～6 min，9 成以上的工作由仪器自主完成[17]。实验无需使用腐蚀性试剂，仅产生少量灰分残渣。近年来，国内外虽然对燃烧法的关注有所提升，但国内对此相关的研究依旧限于凯氏定氮法和燃烧法之间的对比[18-21]，缺少采用燃烧法来检测特定基质中蛋白质含量工艺参数优化的研究。奶粉含水率低、均匀性好，采用燃烧法进行大批量奶粉中蛋白质的测定优势明显。为此，本研究以奶粉为对象，通过单因素试验建立杜马斯燃烧法测定蛋白质含量的最优分析条件并进行验证[22]，为杜马斯燃烧法快速测定奶粉中蛋白质含量的广泛应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

幼儿配方奶粉，市售；天（门）冬氨酸aspartic acid标准物质（GBW(E)100080，N 理论含量10.52%），山东亚学生物科技有限公司；混合催化剂，瑞典FOSS 公司；高纯氧气、高纯二氧化碳，山东鲁中气体有限公司。

1.2 主要仪器

Rapid N cube 氮分析仪，德国Elementar 公司；8400 全自动蛋白质滴定仪，瑞典FOSS 公司；精确度0.1 mg 电子天平，瑞士梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 参数设置

温度参数设置。热导检测器温度：60 ℃；燃烧管温度：960 ℃；二级燃烧管温度：800 ℃；还原管温度：815 ℃。

O2压力设置。O2减压阀输出压力：0.22 MPa。

CO2压力设置。Input 显示值：0.12～0.125 MPa；MFC-CO2显示值：约650 mL/min；Flow-CO2显示值：约650 mL/min。

定义标准物质。选用N 理论含量为10.52%的天（门）冬氨酸aspartic acid 作为校准样品，设置N 测试允许的偏差为5%。

1.3.2 标准品及检测样品的制备

取均匀、干燥的标准品和奶粉样品，称重后用锡箔包装制片。样品制备过程需用镊子或带上手套，确保包装材料不受人为污染。包裹样品后，对包装进行挤压、赶尽空气。

1.3.3 执行样品测试

输入标准品及样品信息、设定通氧方法后，用镊子夹取样品放入进样盘相应的孔位后，启动分析测试。分析测试结束后，校正测试数据、打印测试结果。

2 结果与讨论

2.1 称样量的选择

在相同的通氧条件下（氧气流量300 mL/min，通氧时间140 s），取同一均匀性奶粉样品，选取不同称样量作为一个分析水平进行氮含量测定，同一水平连续测定6 次，结果如表1 所示。

表1 不同称样量对氮含量测定结果的影响（n=6）

由表1 可见，称样量在≤150 mg、≥250 mg 时，结果的相对标准偏差较高；称样量为250、300 mg 时，氮含量测定结果偏高。分析其原因，可能当称样量少时，检测样品代表性不强，加之天平及称量操作的系统误差凸显，从而影响检测的准确性；当取样过多时，样品的燃烧不够充分，进入检测器中的目标物质少，加大分析结果误差。另一方面，样品由于燃烧不完全，会产生与氮气热导系数相近的一氧化碳气体，通过热导检测器，显示结果虚高。所以在进行奶粉中蛋白质含量的测定时，称样质量选择200 mg 比较合适。

2.2 氧气流量的选择

称取（200±20）mg 奶粉样品，设定不同的氧气流量，在相同的通氧时间（140 s）条件下，同一水平对其氮含量连续测定6 次，结果如表2 所示。

表2 不同氧气流量对氮含量测定结果的影响（n=6）

由表2 可见，通氧量不足或通氧过快都会导致样品燃烧不充分，使得试验的误差加大。所以，综合考虑测定结果的RSD 值及测试耗费因素，设定200 mL/min的氧气流量进行奶粉中蛋白质含量的测定较为合理。

2.3 通氧时间的选择

称取（200±20）mg 奶粉样品，在200 mL/min 的氧气流量条件下，分析不同的通氧时间对氮含量检测结果的影响，同一水平连续进行6 次测定，结果如表3所示。

表3 不同通氧时间对氮含量测定结果的影响（n=6）

由表3 可见，通氧时间在60、80 s 时，测得的氮含量偏低，结果的RSD 较大，原因可能在于通氧时间不足，样品没有燃烧转化完全，影响了氮含量的检测结果。当通氧时间在100 s 以上时，测定结果理想，相对标准偏差较小，表明100 s 以上的通氧时间能满足实验对氧气的需求，但通氧时间越长，氧气剩余越多，过剩的氧气会随着进入还原管，氧化还原铜，从而降低其使用寿命。同时出于高效的考虑，最终选取100 s 的通氧时间最为合理。

2.4 优化条件验证试验

通过影响条件的单因素实验分析，建立得到杜马斯定氮仪测定奶粉中蛋白质含量的最佳燃烧条件为：样品称样量为200 mg，氧气流量为200 mL/min，通氧时间为100 s。依据此优化的燃烧条件参数，对样品进行连续氮含量分析，结果如表4 所示。

表4 验证试验结果

为了进一步验证此优化条件的准确性，分别以标准物质天（门）冬氨酸质量与奶粉质量比为1∶1、1∶3 的比例（基于燃烧法分析时，称样量少，称量难度大，可考虑先将样品与标准物质混匀后取样）进行加标回收试验分析，实验结果如表5 所示。

表5 加标回收试验结果（n=6）

2.5 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定结果对比

作为检测蛋白质含量的经典方法，凯氏定氮法因其高的灵敏度、好的准确性，一直是我国国家标准中检测蛋白质含量的仲裁法和新进检测方法的比对标杆。为了进一步验证优化条件的可行性，分别采用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法对同一奶粉样品进行氮含量测定，分析结果如表6 所示。

表6 凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定氮含量结果对比表

表6 结果显示，优化条件下杜马斯燃烧法的测定结果普遍略高于凯氏定氮法，比值D/K 范围为0.993～1.022、趋近于1，绝对差值为0.02。由此看来，2种方法对奶粉中蛋白质含量的检测结果差异不大。而优化条件下的杜马斯燃烧法检验结果的相对标准偏差小于凯氏定氮法，说明该法测定的稳定性要优于凯氏定氮法，原因可能在于杜马斯燃烧法的操作步骤比凯氏定氮法简化的多，由此降低了人为、仪器等各个方面带来的误差。

为了全面考察此优化条件的杜马斯燃烧法与凯氏定氮法对检测相同样品的差异性，对检测结果进行配对t 检验。配对t 检验结果P 值为0.194、大于0.05，说明2 种方法无统计学差异。综上得出结论：优化条件的杜马斯燃烧法能够满足对奶粉中蛋白质含量的检测需求，方法适用性较好。

2.6 注意要点

用杜马斯燃烧法检测样品中蛋白质含量，由于分析样品用量少，所以要求样品有好的均匀性。对于奶粉样品，其样品属性为粉末状态，所以无需经过研磨过筛处理。但需要注意，若样品出现受潮结块等现象，需要提前处理确保检测样品均匀、有代表性；同时为了减小天平和称量带来的误差，对于相同样品，建议平行测定3 次来确保测量结果的准确；制样压片时，要压片紧实，保证锡箔纸内空气全部排出，样品无外漏。

选用纯度较高的标准品同时保证称取量能满足实验稳定准确的需求。每次进行样品分析前，需要进行校正因子的测试，当连续测试30～40 个次样品后，也应再进行一次校正，校正时至少测定3 次标样，消除由于受不同环境条件（气压和温度）的影响，造成仪器系统的微小偏差。

样品进行测试前，做好对仪器运行状态及仪器测试性能的检查。首先检查各填充管的测试次数，在连续进行1 000 次试验后需要对还原管进行检查、替换；连续进样40～50 次后，需要对灰分坩埚进行清理；干燥管中干燥剂有7 成以上湿润变蓝色后，就需要更换新的氧化镁干燥剂。其次，检查操作气体是否流通正常，通气管路是否有堵塞、漏气等情况。能够正常进样、分析的通气条件为：计算机中压力显示0.12～0.125 MPa，二氧化碳流量显示约650 mL/min，Deltap 约232。再就是各个温度的检查，当热导检测器温度达到（60.00±0.01）℃、燃烧管温度达到（960±0.01）℃、二级燃烧管温度达到（800±0.01）℃、还原管温度达到（815±0.01）℃时方可进行样品中蛋白质含量的测试。最后要看下空白值测试情况，保证仪器管路内空气燃烧完全（即TCD 的基线走平）后，再进行样品氮含量分析。

定期对仪器进行清洁、维护，延长仪器使用年限。每次检验完成后，要先对仪器进行降温再关掉仪器电源。定期对仪器进行检查、保养，清洁进样盘、镍板、球阀、石英桥，及时清理、更换干燥剂、还原物质、灰分管、密封圈等。

3 结 论

以奶粉为分析对象，通过一系列单因素试验，建立了杜马斯燃烧法测定奶粉中蛋白质含量的最佳测试条件：样品称样量为200 mg，氧气流量为200 mL/min，通氧时间为100 s。同时对优化的测试条件进行验证，精密度及回收率都能满足实验所需。将此优化条件下的检测方法与凯氏定氮法进行比较，对同一奶粉样品进行蛋白质含量测试结果分析，表明2 种检测方法分析结果无差异性，并且该方法的精密度、准确度更高，同时具有样品消耗少、测试时间短、实验过程绿色环保的优点。当进行大批量奶粉中蛋白质含量分析时，此优化条件下的杜马斯燃烧法具有更加显著的优势。但当样品批数较少时，出于前期仪器调试及检测成本等多方考虑，分析人员可酌情选用检测方法。