纳米黑炭经气管染毒对小鼠肝脏的影响

木 魁，周雨凡，汪瑶琼，邑 晴，方颂平，2，3①

（1.亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800；2.养生型配制酒亳州市重点实验室，安徽 亳州 236800；3.配制酒工程技术研究中心，安徽 亳州 236800；4.药用植物有效成分生物合成亳州市重点实验室，安徽 亳州 236800）

0 引言

2017年，全球大气颗粒物（particulate matter，PM2.5）暴露造成458万人死亡和1.425 2万亿经济损失［1］，PM2.5是导致中国人口死亡仅次于饮食风险、高血压和吸烟的第四大风险因素［2］。PM2.5已被国际癌症研究机构（IARC）列为导致人类肺癌的I类致癌物［3］。黑炭是PM2.5的主要化学组分［4］，是含碳燃料不完全燃烧的产物，对气候变化、空气质量和人类健康有显著的不利影响［5］。典型黑炭的外貌为链式球形小粒子，直径一般为0.01～1.0 μm。由于黑炭颗粒尺寸不同，其在人体内的运动表现也不尽相同。大多数粒子直径超过10 μm的颗粒会在鼻腔和喉咙处就被阻挡，从而无法到达肺中，在咽喉部位，可以利用物理机制除去直径为2.5～10 μm的黑炭粒子，5 μm以下的黑炭颗粒会进入支气管，低于2.5 μm的黑炭颗粒会在肺部最深处沉淀，且进入肺泡，利用气血交换进入血管中，随血液循环进入人体其它脏器中［6］。经肺暴露纳米黑炭会导致小鼠肝脏发生遗传毒性，纳米黑炭长期滞留肝脏可能导致肝癌发生［7］。气管内染毒纳米黑炭颗粒后观察到的肝基因损伤是由肝脏中检测到纳米黑炭颗粒造成氧化应激损伤，而不是由肺部炎症或肝脏急性期反应的继发性作用引起的［8］。目前以纳米黑炭为研究材料经气管暴露多集中在肺部方面的研究，显示纳米黑炭可诱导多种细胞死亡方式，包括自噬、坏死、凋亡、焦亡和铁亡，从而引发心血管和慢性肺阻等多种疾病［9］。纳米黑炭经呼吸系统进入机体后对其他脏器造成的影响研究较少，肝脏是人体最大的实质器官，对毒素的清除、蛋白质的产生和代谢稳态的维持至关重要［10］。大粒径黑炭在机体代谢非常缓慢，黑炭颗粒经气管暴露小鼠180 d，可通过显微镜在肝脏中检测到黑炭颗粒［8］。纳米级黑炭粒径小,具有更强的转运能力，能够随呼吸转运到肝脏部位，通过研究纳米黑炭对小鼠肝脏造成的影响，可以为大气颗粒物对人类健康的危害研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

纳米黑炭，粒径40 nm，购自于北京德科岛金科技有限公司；6周龄的昆明小鼠，购于安徽医科大学实验动物中心。

1.2 试剂及仪器设备

碱性磷酸酶测试盒（南京建成生物工程研究所）；酸性磷酸酶测试盒（南京建成生物工程研究所）；多功能酶标仪（Tecan Infinite M1000 PRO）；石蜡切片机（Leica，德国）；倒置显微镜（奥林巴斯IX73，日本）。

1.3 研究方法

1.3.1 动物分组和染毒

由于雌性小鼠在整个激素周期内的各项生理指标变动并不比雄性小鼠大，甚至雄性动物的有些个体差异表现比雌性个体更为明显［11］，且实验非药物方面的实验，不涉及性别差异，因此全部选取清洁级6周龄的雌性昆明小鼠40只，体重（25±1.3）g，实验前经过7 d的适应性饲养，随机分为4个小组，每组10只，对照组用生理盐水处理。实验组分为暴露1 d、3 d、7 d（每天染毒1 次），采用气管滴注，处理剂量为4 mg/kg。最后一次暴露72 h后处死小鼠摘取小鼠肝脏。

气管滴注方法：配置质量分数为1%戊巴比妥钠，按照3 mL/kg麻醉小鼠，往静脉留置针注入50 μL配制好的黑炭溶液，将针芯抽出，随后将PVC软管插入小鼠声门裂，当看到PVC套管内黑炭溶液随小鼠呼吸，液体发生波动，即可将黑炭溶液打入小鼠气道［12］。

1.3.2 制作组织切片苏木素-伊红染色（HE染色）并观察

小鼠肝脏摘取后，用Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）固定过夜，固定完成后依次置于体积分数为50%、75%、80%、90%、95%、100%酒精各1 h 至完全脱水，然后放入无水乙醇与二甲苯体积比为1:1中进行过渡，在纯二甲苯更换2次进行各透明20 min，然后置于二甲苯与石蜡体积比为1:1中进行过渡，在纯石蜡中进行包埋，冷却后在石蜡切片机上将含有组织的蜡块切成3 μm的组织薄片，在展片机设置42 ℃水浴中展开，用干净粘附载玻片捞取切片，在烘片机上设置50 ℃烘烤载玻片30 min。然后将烘烤完成的切片放入纯二甲苯Ⅰ、纯二甲苯Ⅱ中各20 min 脱蜡，再依次放入无水乙醇20 min，体积分数90%、80%、70%乙醇各2 min后用蒸馏水冲洗干净，切片浸于苏木精溶液中染细胞核10 min，蒸馏水冲洗干净，再将切片浸入伊红染液中染色细胞质2 min，染色完成后将切片依次放入体积分数为70%、80%、90%、95%、100%酒精Ⅰ，100%酒精Ⅱ梯度脱水各2 min，浸入纯二甲苯Ⅰ、纯二甲苯Ⅱ各10 s，透明后拿出晾干，用中性树脂封片，在显微镜下对HE染色的肝脏组织切片进行病理学观察。

1.3.3 小鼠肝脏生化指标测定

为评估小鼠肝脏生化指标，将小鼠肝脏组织先用生理盐水冲洗干净，然后分别称取小鼠对照组和实验组的肝脏组织各0.5 g，分别加入4.5 mL 生理盐水，稀释10 倍。经过组织匀浆后，用冷冻离心机设置1 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，取上清液，分别按照测试盒说明书进行操作检测AKP和ACP含量。

1.4 统计分析

数据图使用GraphPad Prism 8.3软件分析。t检验分析方法进行组间差异分析，其中*代表P＜0.05，表示差异有统计学意义［13］。

2 结果与分析

2.1 纳米黑炭材料形貌观察

为确保实验材料的尺寸和均一度，实验通过透射电子显微镜（TEM）表征纳米黑炭，如图1，结果显示纳米黑炭呈近球形形貌，尺寸符合实验要求的直径40 nm，均一性好，纳米黑炭在自然状态下呈团簇状态，由于纳米黑炭自身的理化特征，纳米黑炭在电镜下显示聚集程度较高。

图1 透射电子显微镜（TEM）的纳米黑炭形貌

2.2 纳米黑炭对小鼠肝脏生化指标的影响

酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）广泛分布于肝脏中，碱性磷酸酶异常预示着肝脏异常。如图2，ACP和AKP在暴露1 d处理均呈现病理性降低（P＜0.05），ACP在暴露3 d和7 d相较于1 d均出现升高，AKP在暴露3 d和7 d呈现降低。

图2 纳米黑炭对小鼠肝脏生化指标影响

2.3 纳米黑炭对小鼠肝脏组织病理学的影响

肝脏组织病理学主要按照炎症细胞活动程度和肝细胞的状态进行评定。炎细胞浸润，指的是炎细胞在炎症灶聚集的现象。气球样变是由于细胞受损后水分增多引起肝细胞胀大、胞浆疏松化，进一步发展肝细胞胀大如球形，胞浆几乎透明，称为气球样变。由图3 可知，对照组小鼠的肝细胞的形态为排列整齐，致密，分布均匀，结构清晰，未观察到病理学改变；暴露1 d处理，可见大量纳米黑炭颗粒在血管中，大量炎细胞浸润血管壁，少量黑炭进入肝脏组织，肝脏细胞无明显炎细胞浸润现象，肝细胞结构清晰，分布均匀；暴露3 d处理，炎细胞大量浸润，肝细胞出现结构异常，排列紊乱，相较暴露1 d炎症细胞在肝脏组织大量浸润，在肝脏组织可见较多黑炭，对肝脏组织造成损伤；暴露7 d处理，大面积肝细胞胀大如球形，胞浆疏松化，透明化严重，发生大量气球样变，肝脏细胞损伤严重。

图3 小鼠肝脏组织病理学切片（HE染色，400×）

3 讨论

由于PM2.5的主要成分不一样及理化性质复杂且不明了，小于2.5 μm的黑炭颗粒能在肺部最深处沉淀，且进入肺泡，利用气血交换进入到血管中，随血液循环进入到人体其它脏器中［6］。大粒径黑炭在机体代谢非常缓慢，黑炭颗粒经气管暴露小鼠180 d，能通过显微镜检测到肝脏中有黑炭颗粒［8］。本研究选取的材料为具有更强转运能力的纳米级黑炭，形状选择近球形，接近自然状态下PM2.5成分黑炭的形貌。商品化纳米黑炭理化成分明确，性质稳定，能更好地探究纳米黑炭对机体健康损伤的机制。

本研究探讨纳米黑炭经气管染毒对小鼠肝脏的影响，纳米级颗粒团聚体在肺部沉积后，有可能分解并作为单个纳米颗粒转移到遥远的位置［14］。结果显示，AKP和ACP 在暴露1 d的时候活性都显著性降低（P＜0.05），但在染毒3 d的时候有所回升，结合病理切片图，染毒1 d，可见大量纳米黑炭颗粒在血管中，大量炎细胞浸润血管壁。染毒3 d，炎细胞大量浸润肝脏组织，肝细胞结构异常，排列紊乱。肝脏对毒素的清除至关重要［10］。ACP和AKP是肝脏损伤标记酶，肝脏AKP和ACP的降低可能是由于细胞组织坏死所致。同时，肝脏具有再生功能，当肝脏组织发生肝再生的过程时，ACP和AKP 的活性也会上升。可以推测出纳米黑炭刚进入小鼠体内1 d时，小鼠肝脏发生炎症反应而后机体免疫系统作出反应，当炎症反应超出肝脏调节能力，炎症反应会对肝脏造成损害［10］，肝脏损伤是由纳米黑炭氧化应激造成的损伤，而不是由肺部炎症或肝脏急性期反应的继发性作用引起的［8］。染毒3 d时，纳米黑炭滞留肝脏，会导致小鼠肝脏发生遗传毒性，可导致肝脏损伤加重［7］。病理切片可看出,小鼠染毒7 d 的时候已经出现大量肝细胞胀大，胞浆疏松化、透明化严重，发生大量气球样变，这与黑炭颗粒经气管暴露小鼠180 d的结果一致，均在肝脏检测到黑炭颗粒［8］，但由于其实验选取材料是粒径较大黑炭，转运能力弱，所以必须长期染毒才能在肝脏检测到黑炭颗粒，这就揭示粒径越小的纳米黑炭在暴露过程中毒性更强，对其他脏器的影响更大。虽然肝脏在对慢性损伤的病理具有修复功能，人们实际生活中每天都会暴露大气颗粒，长期来看由于纳米黑炭滞留肝脏组织，持续对肝脏造成损伤程度比肝脏再生能力要强，因此可能导致肝癌风险 增加［7］。

经气管滴注的纳米黑炭会对小鼠肝脏组织产生损害，并且当纳米黑炭暴露的时间越长，对小鼠肝脏产生的损害会更严重。总之，纳米黑炭会蓄积在小鼠肝脏中，对小鼠肝脏组织产生损害，由于纳米黑炭滞留肝脏造成氧化应激与炎症损伤，对肝脏直接造成遗传毒性。