高效液相色谱法同时测定胃特安片中4 种成分含量*

徐 兰，李 刚，彭 秘，肖汉扬，胡文弋，陈昊东，刘碧莹，张增珠

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院，江西 南昌 330002）

胃特安片为医院制剂，由枳实、泽泻、白术、川芎、厚朴、半夏、陈皮、黄柏8味中药材组方，具有和胃止痛、健脾消食、安神宁心等功效，临床主要用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性胃炎等疾病［1］。方中，枳实具有破气消积、化痰散痞等功效［2］，被广泛应用于治疗心血管、胃肠道等疾病，其有效成分为辛弗林［3］；泽泻具有利水渗湿、泄热、化浊调脂等功效，可用于治疗小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、高脂血症等［4］，其主要药效物质基础为23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C［5］；陈皮可理气健脾、燥湿化痰，主要活性成分为橙皮苷［6］。枳实和泽泻为君药，但目前尚未对两药的主要成分进行含量测定，无法有效控制胃特安片的质量。胃特安片含有多种中药材，不同组分间协同发挥药效，基质、成分较复杂。为提高检测准确度，参考文献［2-16］，以及2020年版《中国药典（一部）》中枳实［7］258、泽泻［7］239和陈皮［7］199含量测定项下的指标性成分，本研究中建立了同时测定胃特安片中辛弗林、橙皮苷、23 - 乙酰泽泻醇B 和23-乙酰泽泻醇C 4 种成分含量的高效液相色谱法，旨在提高胃特安片的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 16 型高效液相色谱仪［配有LC - 16 型泵，SPD-M40型二极管阵列（DAD）检测器］，AUW220D型电子分析天平（精度为十万分之一），均购自日本Shimadzu公司；KM - 410C 型智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司，功率为220 W，频率为70 kHz）；AZJ-2002-C型超纯水仪（美国Millipore 公司）；DFT - 50 型手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；DK -98 - ⅡA 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；TGL-16C 型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

辛弗林对照品（批号为110727 - 202110，含量为99.8%），橙皮苷对照品（批号为110721-202220，含量为97.2%），23-乙酰泽泻醇B对照品（批号为111846-202006，含量为98.3%），23-乙酰泽泻醇C 对照品（批号为112062 - 202102，含量为99.2%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱纯，西陇化工股份有限公司）；庚烷磺酸钠（上海蓝季科技发展有限公司，批号为39083，含量为99.9%）；胃特安片（医院自制，批号分别为20220218，20220516，20220722，规格为每片0.4 g）；水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Intersil ODS - 3 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为乙腈，B为磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾0.6 g，庚烷磺酸钠1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀释至1 000 mL），梯度洗脱（0～7 min 时12%A，7～14 min 时12%A →75%A，14～20 min 时75%A →90%A，20～25 min 时90%A，25～30 min 时90%A →12%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm（0～7 min，辛弗林），283 nm（7～10 min，橙皮苷），246 nm（10～20 min，23-乙酰泽泻醇C），208 nm（20～30 min，23-乙酰泽泻醇B）；柱温：室温；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

取辛弗林对照品8.300 6 mg、橙皮苷对照品9.432 7 mg、23-乙酰泽泻醇B对照品7.328 6 mg、23-乙酰泽泻醇C对照品4.451 6 mg，精密称定，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得质量浓度分别为0.828 4，0.916 9，0.720 4，0.441 6 mg/mL 的对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各0.5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得质量浓度分别为16.57，18.34，14.41，8.83 μg/ mL 的混合对照品溶液。取样品适量，粉碎，取细粉（过60 目筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率为220 W，频率为70 kHz）处理60 min，静置并冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心（转速为5 000 r/min）10 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方工艺分别制备缺泽泻、枳实和陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果4 种成分的色谱峰分离度大于1.5，理论板数均大于3 000，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

1.辛弗林 2.橙皮苷 3.23 - 乙酰泽泻醇C 4.23 - 乙酰泽泻醇BA.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C - E.阴性对照品溶液（分别缺枳实、泽泻、陈皮）图1 高效液相色谱图1.Synephrine 2.Hesperidin 3.Alisol C 23 - acetate 4.Alisol B 23 - acetateA.Mixed reference solution B.Test solution C - E.Negative reference solution（lacking Aurantii Fructus Immaturus，Alismatis Rhizoma，and Citri Reticulatae Pericarpium，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下4种成分的对照品贮备液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，按2.1项下色谱条件进样测定，各待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得各待测成分的回归方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 6）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液和供试品溶液各20 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果混合对照品溶液中辛弗林、橙皮苷、23 - 乙酰泽泻醇B 和23 - 乙酰泽泻醇C 峰面积的RSD分别为1.68%，2.47%，1.02%，1.41%（n= 6），供试品溶液中以上4 种成分峰面积的RSD分别为0.85%，1.94%，1.35%，0.92%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液适量，分别于室温放置0，2，4，6，8，12 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果辛弗林、橙皮苷、23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C 峰面积的RSD分别为3.48%，2.86%，3.81%，4.24%（n= 6），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为20220516）6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果辛弗林、橙皮苷、23 - 乙酰泽泻醇B 和23 - 乙酰泽泻醇C 的含量分别为0.414 0，0.457 8，0.357 3，0.219 5 mg/ g，RSD分别为2.92%，2.80%，3.02%，3.95%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知4 种成分含量的样品（批号为20220516）适量，粉碎（过60目筛），取细粉1.0 g，精密称定，分别精密加入4 种成分对照品贮备液各500 μL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 样品含量测定

取样品（批号分别为20220218，20220516，20220722）适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以外标法计算样品中4 种成分的含量。结果见表3。

表3 样品中4种成分含量测定结果（mg/片）Tab.3 Results of the content determination of four components in Weite'an Tablets（mg / tablet）

3 讨论

3.1 检测波长选择

全波长范围扫描4 种化合物，辛弗林、橙皮苷、23-乙酰泽泻醇B 和23 - 乙酰泽泻醇C 分别于275，283，208，246 nm 波长处有明显吸收，差异较大，杂质干扰较少。采用DAD 检测器实时扫描功能，获得所有波长下的色谱图和即时色谱图，可提高检测效率，实现了在同一色谱条件下4 种活性成分最大吸收波长处同时测定含量的目的。

3.2 流动相选择

因辛弗林为含氮生物碱类化合物［3］，极性较强，一般流动相系统中不易在色谱柱上保留，如前期试验考察乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水等流动相系统时发现，辛弗林在色谱柱上呈极弱保留，且保留时间很不稳定。在乙腈- 磷酸二氢钾溶液中加入离子对试剂庚烷磺酸钠后，辛弗林在色谱柱上的保留时间延长，稳定性较好，且胃特安片中其他组分未产生明显干扰，故本研究中选择2.1项下流动相系统。

3.3 提取溶剂与方法选择

本研究中考察了不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、乙腈、2%冰醋酸溶液对待测成分提取效果的影响，结果显示，酸性溶剂提取后测得样品中辛弗林的含量最高，这可能是由于辛弗林属生物碱类化合物［8］，在酸性溶剂中可成盐而增加了溶解度，但其他3种成分的含量非常低。不同提取溶剂中，4种成分总含量从大到小依次为甲醇、75%甲醇溶液、50%甲醇溶液、2%冰醋酸溶液、乙腈。4 种成分结构中均含有羟基，在醇溶液中有较高的溶解度，综合考虑后选择甲醇为提取溶剂。曾考察不同提取方法（回流、超声）和提取时间（30，60，90 min）对待测成分提取效果的影响，结果显示，超声提取法效果优于回流提取法。超声提取法有利于甲醇渗透穿过枳实、泽泻和陈皮的细胞壁和细胞膜，能很好地将4种成分同时溶出，提取率较高，且操作简便；超声提取时间越长，提取效果越好，但超声处理60 min和90 min 所测得4 种成分的含量无显著差异。故最终选择2.2项下供试品溶液的制备方法。

3.4 方法评价

本研究中建立的方法操作简便、结果准确、重复性好，可用于胃特安片中多种成分含量的同时测定。