高效液相色谱串联质谱法同时测定人血浆中加巴喷丁和普瑞巴林浓度*

李银洛，唐才林，盛长城，陈 宇，龙兴震，白 雪△

（1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002； 2.贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002； 3.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550002）

带状疱疹后神经痛（PHN）是带状疱疹的常见并发症，疼痛剧烈，常用药物非甾体类解热镇痛药和阿片类镇痛药的疗效均不理想。加巴喷丁和普瑞巴林是治疗PHN 的一线药物，但对50%的患者治疗无效或疗效欠佳［1-2］。据报道，加巴喷丁和普瑞巴林的个体间血药浓度差异大［3-4］，其血药浓度与临床疗效、不良反应存在相关性［5］。部分国家要求对服用加巴喷丁和普瑞巴林的患者进行血药浓度监测［6］，但我国尚未见相关报道。在PHN 的临床药物治疗中，常用治疗方案为当加巴喷丁治疗无效时换用普瑞巴林或普瑞巴林治疗无效时换用加巴喷丁，并非同时使用。有研究报道，两药联用可提高治疗有效率，减少不良反应和用药剂量［7-9］。加巴喷丁和普瑞巴林的血药浓度监测可为评估PHN 患者的给药剂量、血药浓度与疗效和不良反应的相关性提供参考，提高PHN 药物治疗的有效性和安全性。目前，加巴喷丁和普瑞巴林的血浆药物浓度测定方法有高效液相色谱法［10-11］、液相色谱- 荧光法［12-13］和液相色谱-质谱法［14-15］等但两药均无紫外吸收，需进行柱前衍生化，导致血浆样品前处理复杂，检测时间长，同时测定两药血药浓度的方法尚未见报道。为此，本研究中建立了同时测定血浆中加巴喷丁和普瑞巴林浓度的高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）法，以期为提高临床治疗PHN 的有效率及个体化药物治疗提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB SCIEX 3500 型高效液相色谱- 三重四极杆串联质谱联用仪（美国AB Sciex公司），操作软件工作站为Analyst 1.6.3；AL204 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo，精度为万分之一）；TGL - 16WC 型高速台式冷冻离心机（长沙湘锐离心机有限公司）；XH - B 型涡旋混合器（江苏康健医疗用品有限公司）。

1.2 试药

加巴喷丁对照品（批号为100655-201903，含量为99.8%），普瑞巴林对照品（批号为101106-202003，含量为99.4%），茶碱对照品（批号为100121-201805，含量为99.9%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈（HPLC 级），甲醇（LC 级），均购于美国Tedia 公司；甲酸（LC级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；空白血浆取自志愿者；纯净水（华润怡宝饮料有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

预柱：Phenomenex Security GuardTMULTRA 柱；色谱柱：Phenomenex Luna®Omega C18柱（50 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（程序见表1）；流速：0.30 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）；离子极性及检测模式：正离子多反应监测（MRM）模式；喷雾电压（IS）：5 500 V；雾化温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）：30.0 psi（氮气）；碰撞气（CAD）：7 psi；雾化气（GS1）：50.0 psi；辅助气（GS2）：50.0 psi；入口电压（EP）：10 V。其余参数见表2。

表2 质谱条件部分参数设置Tab.2 Partial parameter settings for mass spectrometry conditions

2.2 溶液制备

系列混合标准曲线工作液：取加巴喷丁和普瑞巴林对照品各适量，精密称定，置不同容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容，分别配制成质量浓度为1.00 mg/mL的对照品贮备液，于4 ℃冰箱中保存，备用。取上述对照品贮备液各适量，混匀，用50%甲醇溶液逐级稀释，得质量浓度分别为1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00，64.00，96.00，128.00 μg/mL的系列混合标准曲线工作液。

系列混合质控工作液：取上述对照品贮备液各适量，混匀，用50%甲醇溶液逐级稀释，得质量浓度分别为2.00，64.00，96.00 μg/mL 的系列混合质控工作液。同时，配制质量浓度为1.00 μg/mL 的混合定量下限工作液。

内标工作液：取茶碱对照品适量，精密称定，用50%甲醇溶液溶解，超声处理，定容，配制成质量浓度为1.00 mg/ mL 的内标贮备液，于4 ℃冰箱中保存，备用。用50%甲醇溶液作为稀释溶液，配制质量浓度为20.00 μg/mL的内标工作液。

标准曲线和质控血浆样品：取空白血浆样品90 μL，置1.5 mL 离心管中，加入10 μL 系列混合标准曲线工作液（或系列混合质控工作液）和内标工作液，涡旋，混匀，加入290 μL 有机溶剂甲醇沉淀血浆蛋白，涡旋1 min，低温高速离心（4 ℃，12 000 r/ min）10 min，取上清液，即得。

2.3 血浆样品前处理

取血浆样品100 μL，置1.5 mL 离心管中，加10 μL内标工作液，涡旋，混匀，加290 μL 甲醇沉淀血浆蛋白，涡旋1 min，低温高速离心（4 ℃，12 000 r/min）10 min，取上清液适量，注入液相色谱仪自动进样器模块（温度设为10 ℃）中，进样分析。

2.4 方法学考察

专属性试验：取不同来源的志愿者空白血浆90 μL，分别加入10 μL系列混合质控工作液和内标工作液，按2.3 项下方法处理，即得；取空白血浆，按2.3 项下方法处理，即得；取空白血浆90 μL，分别加入加巴喷丁和普瑞巴林对照品溶液（质量浓度为6.40 μg/ mL）10 μL，混匀，按2.3 项下方法处理，即得。结果显示，加巴喷丁和普瑞巴林的出峰时间分别为2.51 min 和2.50 min，在其对应离子通道下，血浆样品中内源性物质不干扰待测化合物的色谱峰。色谱图见图1。

1.加巴喷丁 2.普瑞巴林A.空白血浆 B.空白血浆+ 加巴喷丁、普瑞巴林和内标对照品溶液 C.空白血浆+ 加巴喷丁对照品溶液（质量浓度为6.40 μg / mL）D.空白血浆+ 普瑞巴林对照品溶液（质量浓度为6.40 μg / mL）图1 高效液相色谱串联质谱图1.Gabapentin 2.PregabalinA.Blank plasma B.Blank plasma + gabapentin，pregabalin and internal standard reference solution C.Blank plasma + gabapentin reference solution（mass concentration：6.40 μg / mL）D.Blank plasma + pregabalin reference solution（mass concentration：6.40 μg / mL）Fig.1 HPLC chromatograms

标准曲线建立和定量下限（LLOQ）确定：取血浆样品90 μL，置1.5 mL 离心管中，分别加入10 μL 系列标准曲线工作液和内标工作液，涡旋，混匀，加290 μL 有机溶剂甲醇沉淀血浆蛋白，涡旋1 min，低温高速离心（4 ℃，12 000 r/ min）10 min，取上清液，即得加巴喷丁和普瑞巴林质量浓度分别为100.00，200.00，400.00，800.00，1 600.00，3 200.00，6 400.00，9 600.00，12 800.00 ng/ mL 的系列标准曲线血浆样品。取适量，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定，以加巴喷丁和普瑞巴林的质量浓度（X，ng/ mL）为横坐标、待测物的峰面积（As）与内标峰面积（Ai）比值（Y）为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归分析。得回归方程分别为Y加=0.002 1X加- 0.051 9（r= 0.999 2，n= 9）和Y普=0.000 7X普-0.01 4（r=0.999 6，n=9）。结果表明，加巴喷丁和普瑞西林的质量浓度在100.00～12 800.00 ng/ mL范围内与待测物和内标峰面积比值线性关系良好。2 种待测物的LLOQ为100.00 ng/mL。

精密度与准确度试验：定量吸取90 μL 空白血浆，分别加入内标和LLOQ、低、中、高4 种质量浓度（100.00，200.00，6 400.00，9 600.00 ng/mL）的系列混合质控工作液各10 μL，按2.3项下方法操作，即得加巴喷丁和普瑞巴林的混合质控血浆样品。每个质量浓度平行制备6份样品，连续制备3 d并测定，用标准曲线计算日内、日间精密度和准确度。结果显示，加巴喷丁和普瑞巴林的日内、日间精密度试验的LLOQ 样品均值在标示浓度± 20%范围内，RSD均小于20%（n= 6）；低、中、高3 种质量浓度样品均值在标示浓度± 15%范围内，RSD均小于15%（n=6）。详见表3。

表3 血浆中加巴喷丁和普瑞巴林的精密度与准确度试验结果（n=6）Tab.3 Results of precision and accuracy tests of gabapentin and pregabalin in plasma（n = 6）

提取回收率和基质效应：配制血浆样品，2 种待测物低、中、高质量浓度依次为200.00，6 400.00，9 600.00 ng/mL，各平行6 份，按2.3 项下方法操作，进样检测加巴喷丁、普瑞巴林和内标的峰面积（A）。取200 μL 空白血浆样品，加600 μL 有机溶剂甲醇沉淀蛋白后，取上清液380 μL，分别加入低、中、高质量浓度的系列混合质控工作液和内标工作液各10 μL，混匀，置低温高速离心机中离心10 min，取上清液，检测加巴喷丁、普瑞巴林和内标的峰面积（B）。定量吸取90 μL 甲醇，分别加入低、中、高质量浓度的系列混合质控工作液和内标工作液各10 μL，混匀，加300 μL甲醇，置低温高速离心机中离心10 min，取上清液，检测加巴喷丁、普瑞巴林和内标的峰面积（C）。计算提取回收率和基质效应，提取回收率（%）=A/B× 100%，基质效应（%）=B/C×100%。结果，血浆中加巴喷丁和普瑞巴林的低、中、高质量浓度的提取回收率分别为93.89% ～101.55% 和94.38%～101.93%，基质效应分别为88.76%～100.95% 和91.87%～102.08%，均符合要求。内标的提取回收率和基质效应的平均RSD分别为9.56%和5.77%，均小于15%，符合要求。详见表4。

表4 血浆中加巴喷丁与普瑞巴林的提取回收率和基质效应结果（n=6）Tab.4 Extraction recovery rate and matrix effect results of gabapentin and pregabalin in plasma（n = 6）

稳定性试验：不同保存条件下，低、中、高质量浓度加巴喷丁和普瑞巴林血浆和储备样品的稳定性，各平行6 份，分别置常温下8 h，常温24 h，进样室24 h，4 ℃冰箱48 h，-80 ℃冰箱24 h 反复冻融3 次，-80 ℃冰箱40 d。结果的RSD均小于15%，表明加巴喷丁和普瑞巴林样品均稳定。

2.5 人体药代动力学研究方案与应用

该研究方案已获贵州省人民医院伦理委员会批准［批件号为伦审字（科研）〔2019〕75 号］，患者签署知情同意书。纳入服用加巴喷丁或普瑞巴林的PHN 患者各20 例，采用滴定给药方式，加巴喷丁和普瑞巴林最大给药剂量分别为1.50 g/d 和0.30 g/d。口服加巴喷丁表现出饱和吸收，即一种非线性（零级）过程，使其药代动力学更难预测，血药浓度不随剂量增加而成比例增加；普瑞巴林的吸收是线性（一级）过程，血浆浓度随剂量的增加而增加。在药物给药剂量稳定后，持续服药48 h，于次日清晨采集患者空腹静脉血，并按上述方法进行检测，结果见表5。加巴喷丁的血药浓度为4 083.62～12 287.04 ng /（mL·g），经 剂 量 校 正 后 浓 度 为2 268.68～13 652.27 ng/（mL·g）；普瑞巴林的血药物浓度为2 307.04～6 588.49 ng/（mL·g），经剂量校正后浓度为11 987.27～36 518.73 ng/（mL·g）。可见，患者体内两药的血药浓度差异较大。因此，有必要对这2 种药物进行血药浓度监测，并在后续研究中探讨血药浓度和临床疗效间的对应关系，从而为患者的药物治疗剂量制订及个体化用药提供参考。

表5 患者血浆中加巴喷丁与普瑞巴林的药物浓度Tab.5 Concentration of gabapentin and pregabalin in patient's plasma

3 讨论

方法建立阶段，分别尝试了不同比例的等度洗脱和梯度洗脱来优化待测物和内标的峰形、保留时间，最终选择上述方法中的梯度洗脱程序。后续考察了水相中不同浓度的甲酸体积分数（0.05%，0.10%，0.15%），5.00 mmol/ L 醋酸铵（0.10%甲酸），50.00 mmol/ L 磷酸二氢钠（pH=2.5），有机相分别采用甲醇和乙腈进样测试，较多出现峰形分叉、肩峰或拖尾现象，最终采用0.10%甲酸水溶液和乙腈，可得到较好的峰形和响应。在血浆样品前处理阶段，分别尝试了甲醇和乙腈作为沉淀剂的一步蛋白沉淀法，该方法操作简便，进样后2 种沉淀剂的峰形和响应相差不大，最后选择价格便宜、毒性较小的甲醇作为沉淀剂。

国内目前的加巴喷丁和普瑞巴林治疗PHN 研究大部分为临床疗效的观察。患者在服药后常存在治疗无效的情况，且由于采用逐步递增的给药剂量方式，使达到给药剂量后药物无效更换药物时患者需忍受更多疼痛。相同给药剂量下，加巴喷丁和普瑞巴林的血药浓度存在显著的个体差异，故血药浓度比给药剂量能更直观地反映药物的体内效应。本研究中为后续加巴喷丁和普瑞巴林的血药浓度监测奠定了方法学基础，以期通过对患者的血药浓度监测，为止痛效果不理想PHN患者的下一步治疗策略提供参考，减少患者的痛苦。同时，该方法学的建立也为下一步临床探索加巴喷丁和普瑞巴林联合个性化治疗难治性PHN 提供了治疗药物监测的方法学基础。

综上所述，本研究中建立了同时测定PHN 患者血浆中加巴喷丁和普瑞巴林浓度的高效液相色谱串联质谱法，血浆样本前处理简单，检测速度快，稳定性好，血浆消耗量少，可为临床提供大量样本测定。