小田块中稻瘟菌营养体亲和群复杂性研究

王谣，丁航，李聪，邓清超

(长江大学 农学院，湖北 荆州 434002)

稻瘟菌(Magnaportheoryzae)是一种丝状子囊真菌(Filamentous fungus)，其无性态为灰梨孢菌(Pyriculariaoryzae)，属半知菌门(Deuteromycotina)梨孢属(Pyricularia)；有性态稻瘟菌属于子囊菌属(Ascomycete)[1-2]为人工培养形式，目前在自然界中并未被发现。稻瘟病是世界上危害粮食作物水稻的重要病害，发病症状不一，其发生不受地域、季节的影响[3]，对全球的粮食安全生产造成极大威胁[4-5]。稻瘟病的防治措施主要包括化学药剂防治、抗病品种选育等[6]。其中化学药剂防治是最快、最直接的方法，但其对环境危害也是最大的，稻瘟病菌在与抗病品种互作中容易变异产生新小种，使得长期种植单一抗病品种往往在几年后其抗病效果在自然界中会降低[7]。综上所述，大力发展可替代的安全防控措施势在必行，生物防治是稻瘟病防控研究和实践的一个重要发展方向[8]。真菌病毒在植物真菌病害的生物防治方面所具有的实践价值已日益凸显，真菌营养体不亲和性是影响弱毒相关真菌病毒生物防治应用的最主要因素。弱毒病毒在降低宿主的致病力方面起到了重要作用，是真菌病害自然降低的主要机制之一，在植物病害生物防治方面有着重要的应用价值。稻瘟菌中Partitiviridae科相关弱毒病毒Magnaportheoryzaepartitivirus 2 strain YC13(MoPV2-YC13)能显著降低稻瘟菌分生孢子产量，降低了对活体大麦的致病性[9]；Chrysoviridae科病毒MOCV1会引起稻瘟菌菌丝生长形态、细胞形态出现异常，黑色素减少，生长速率下降，分枝明显增多，同时出现产孢减少，气生菌丝形成受阻等不正常状态[10-11]。

真菌营养体亲和性(vegetative compatibility，简称VC)指同一种真菌的不同菌株之间菌丝能够相互融合，进而交换细胞质或核物质的特性。通常将具有相互亲和能力的真菌菌株定义为一个营养体亲和群(vegetative compatibility group，VCG)[12-13]，属于同一VCG的菌株相互能够在细胞融合后形成稳定的异核体；而属于不同VCG的菌株间在细胞融合时就会发生营养体不亲和 (vegetative incompatibility，VIC)反应，不能形成异核体并引发程序性的细胞死亡 (programmed cell death，PCD)[14-17]。VIC作为真菌的一种自我-非自我的识别机制[16]，阻止了异核体的形成从而抑制了一些侵染性有害因子，如真菌病毒、变异线粒体和超数染色体等在真菌种群内的传播与扩散[17-19]。真菌病毒在田间传播难易程度与种群营养体亲和群(VCG)数量多少有关，VCG数量越多真菌病毒就越难传播。低毒力病毒CHV1侵染板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)能够引起板栗疫病菌毒力的下降，例如在防治欧洲板栗疫病时CHV1对栗疫病的生物防治已经取得了很大成功[20]，而在北美CHV1却没有成功防治板栗疫病，其中一个原因就是北美洲栗疫病菌的种群VCG比较复杂[16]。

本研究旨在通过不同菌株间进行VIC测定，明确小田块中稻瘟菌群体VCG的复杂程度，以评估用弱毒真菌病毒在小田块内防控稻瘟病的效率与可行性。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2021年9月于位于恩施市白果乡两河村的湖北省农业科学院所属50 m×60 m的试验田中，间隔10 m以上采集水稻穗颈瘟病样，经单孢分离获得本实验所用菌株ES31～ES76。

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌分离、纯化

取水稻穗颈瘟病样，剪成约1.5 cm长的小段，放入铺菌培养皿中的滤纸上进行保湿培养，28 ℃黑暗培养18 h，通过体式显微镜可以观察到病斑部位产生大量稻瘟菌分生孢子。将单个病样的分生孢子抖落于水琼脂培养基平板(d=9 cm)上，28 ℃培养1 d，在体式显微镜下观察并用毛细管灼烧拉成的细针挑取水琼脂培养基平板上单个分生孢子萌发形成的微菌落，转移至新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)平板(d=6 cm)上进行纯化培养。每个病样挑取6个单孢菌株，在PDA平板上生长出来的单孢菌株在其菌落直径达到3 cm左右，可从中选取1个菌株进行保藏。

1.2.2 稻瘟菌营养体不亲和性测定

真菌菌株间的营养体不亲和VIC检测主要是采用对峙培养法(barrage test)[21]。参试菌株在PDA培养基上(d=6 cm)活化3 d后，于菌落边缘切取2 mm×2 mm的幼嫩菌丝块转移到新的PDA培养基上(d=9 cm)进行对峙培养，接种的两菌丝块之间相隔0.50～0.75 cm，每个组合进行3次重复并对培养皿进行密封处理。28 ℃黑暗培养箱培养4～5 d之后，观察PDA培养基(d=9 cm)上两菌落交界处是否产生拮抗反应(barrage formation)，即是否出现一条肉眼可见的白色抗衡带。若两菌株间的菌落交界处没有明显的抗衡带，即两菌株菌丝完全融合并且能够正常生长，则两菌株为营养体亲和(VC)；反之，则两菌株为营养体不亲和(VIC)。

1.2.3 数据处理与统计分析

通过Excel对所有参试菌株组合的VIC测定结果进行统计，对菌株之间亲和的比例以及营养体亲和群的划分进行分析。

2 结果与分析

2.1 稻瘟菌不同菌株间对峙培养的表型

本实验通过对不同菌株间两两进行对峙培养(barrage test)[21]，观察记录到配对培养结果显示为亲和与不亲和两种。亲和型反应现象表现为Ⅰ型，在两菌株交界处的菌丝完全融合且正常生长，没有形成抗衡带，其中A1、A2、A3分别为对峙培养的培养皿的正反两面，以及透光条件下的反面；而不亲和反应现象存在两种主要类型：Ⅱ型，两菌株菌丝交界的地方产生一条清晰的白色抗衡带，B1、B2、B3分别为对峙培养的培养皿的正反面，以及透光条件下的反面；Ⅲ型，两菌株菌丝交界的地方形成一条清晰的白色抗衡带，且菌落颜色较浅的菌株在靠近抗衡带附近的菌丝颜色也会加深，C1、C2、C3分别为对峙培养的培养皿的正反面，以及透光条件下的反面(图1)。

2.2 稻瘟菌营养体不亲和性测定

将46个菌株分别进行两两配对之后，对所有观察到的对峙培养反应结果进行统计和分析，发现在1 058个(46×46)配对组合中，大多数配对组合(818对)表现为VIC，占配对组合总数的77.3%，表现为VC的配对组合数量较少(240对)，占配对组合总数的22.7%。

对数据进行深入分析，根据VCG的定义，可将 46个稻瘟菌菌株中的20个归入16个互不亲和的VCG中(表1)，其余的26个菌株由于与多个VCG的全部或部分成员亲和，不能归入任何VCG之中(表2)。需要注意的是，即使是属于同一VCG的两个菌株，与其他菌株的VC反应也并不完全相同，比如菌株ES31、ES45同属于亲和群1，ES45与ES30、ES31、ES33、ES36亲和，但是ES31只与ES45、ES55亲和。

表1 参试稻瘟菌株的VCG分析

表2 与多个VCG的全部或部分成员亲和的菌株

3 讨论

本文借鉴了前人的研究方法，在稻瘟菌上建立了一种鉴定营养体亲和性的方法即对峙培养法(barrage test)[21]，并利用该方法对小田块中稻瘟菌群体的营养体亲和群复杂度进行了分析和评估。本实验分离得到了46株稻瘟病病株，经过VIC测定和VCG分析后发现了16个互不亲和的VCG，且其中12个VCG都只有一个成员，另外4个VCG也只有2个菌株，且2个同属于一个VGC的菌株与其他菌株的VC反应并不完全相同；另外26个菌株能够与两个以上的VCG的全部或部分成员亲和，不应划分入任何VCG中。参试的46个菌株中，任何两个菌株与其他菌株的VC反应都不完全相同。本研究显示，即使在小田块中，稻瘟菌群体也有着非常复杂的VCG结构。

稻瘟菌复杂的种群遗传结构，是其具有快速变异性和高度环境适应性的原因和基础。邓云等[22]用抗性基因分子标记检测福建省稻瘟病生理小种优势种群，分析致病率，为农业生产布局优化方案。刘伟等[23]利用已知水稻鉴别品种对辽宁省野生稻瘟病菌进行生理小种鉴定，发现稻瘟病菌群体的生理小种结构非常复杂；李海伦等[24]采用群体遗传学的方法，也发现在特定小环境中的稻瘟菌群体多样性远远高于在水稻上分离得到的稻瘟菌群体。本研究从VCG的角度出发，从另一个侧面也印证了之前的诸多研究，证明了即使在小田块中，稻瘟菌群体也有着非常复杂的遗传结构。

不同VCG菌株间的VIC反应会严重限制真菌病毒的水平传播，影响弱毒相关真菌病毒对稻瘟病的生物防治效率。真菌病毒通常缺少体外传播途径，只能通过孢子释放进行垂直传播或通过菌株间的菌丝融合进行水平传播，VIC成为影响弱毒相关病毒传播和生物防治效率的最主要因素[18，25-27]。选择了实验室的带毒稻瘟菌株与本实验中的46个菌株采用对峙培养法进行培养，发现带毒菌株与本实验中的菌株均不亲和，且病毒均未发生传递，再次证明了真菌病毒在不同营养体亲和群间不易传播。实验室中其他菌株与带毒稻瘟菌株进行对峙培养发现病毒传递成功的两菌落接触区出现扇变。本研究还发现，参试的约半数菌株可以与多个VCG的部分或全部成员亲和，推测野生稻瘟菌群体中存在vic基因自然缺失的突变体[28]，或存在由非等位的vic基因控制的VIC反应[29]。

本文在前期研究中初步发现在自然环境中的稻瘟菌群体可能有着非常复杂的VCG，病毒在不同VCG间很难发生水平传播。本研究为后续评估稻瘟病发生地区采用真菌病毒生物防治的难易程度提供一定的理论基础以及为后续鉴定稻瘟菌亲和性功能基因提供一定的基础数据。

4 结论

本实验对在恩施地区实验田块(0.27 hm2)中分离得到了46株的稻瘟病病株，将采集分离得到的稻瘟病病株经过VIC测定和VCG分析后发现，结果显示，在恩施田块采集的稻瘟菌菌株中有16个互不亲和的VCG，并且多数VCG只包含1到2个菌株。这表明即使在小田块中，稻瘟菌群体也比较复杂。虽然用于进行VCG测定的稻瘟菌菌株的数量仍然较少，而且只选择了恩施稻瘟菌监测苗圃，但也能说明稻瘟菌群体的VCG复杂度高，VCG间的VIC反应在将来也许对弱毒相关病毒进行生物防治应用有不小的阻碍。在后续研究中将扩大研究范围对更多不同地域的稻瘟菌群体的VCG复杂性进行分析，完善研究内容，以期能够对我国的稻瘟菌群体的VCG复杂程度有一个更为完整和准确的评估。