蝴蝶兰黑头病的病原诊断和防治方法

周勤，徐丹彬，方丽，叶琪明，缪强，万华建，邱春英，王汉荣*

(1.浙江省农业技术推广中心，浙江 杭州 310021；2.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021；3.杭州市富阳区农业农村局，浙江 杭州 311499；4.杭州市西湖区农业技术推广服务中心，浙江 杭州 310013；5.杭州市萧山区农林业技术推广中心，浙江 杭州 311200)

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物，原产地为热带、亚热带地区，素有“洋兰皇后”的美誉[1]。20世纪90年代末，蝴蝶兰作为一款高档花卉从中国台湾引入大陆，其叶片宽厚碧绿、花色多彩俏丽、花型优美大气，符合国人喜庆、热闹、团圆等传统气氛，结合其花期长等优点，成为年宵花和礼品花的首选[2]，广受消费者的喜爱。近年来，随着蝴蝶兰趋向于平价化，浙江省蝴蝶兰年交易量基本稳定在500万株左右，销售额达上亿元，并有不断发展的趋势。但蝴蝶兰在栽培过程中容易发生一种病害，肉质叶的基部发黑变褐导致茎基部腐烂，花农称该病为黑头病。目前，不同蝴蝶兰品种黑头病的发生差异较大，易感品种的病株率为5%～50%，催花抽梗后发病尤为严重。由于该病发病初期不易被发现，一旦发现难以防控，且发病速度迅猛，花农损失较大，成为遏制蝴蝶兰产业发展的瓶颈之一。

为了促进蝴蝶兰产业的快速健康发展，2021年浙江省启动了农业重大技术协同推广计划项目，项目组调查了杭州兰派农业科技有限公司、杭州百盛精准农业有限公司和浙江启美生态农业有限公司等杭州市主要蝴蝶兰生产企业的黑头病发生情况和品种抗性等，鉴定了引起黑头病的主要病原，并提出预防蝴蝶兰黑头病发生的关键节点和技术方法，为蝴蝶兰产业的高质量发展提供切实有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 病样的采集

2021年11月，在杭州兰派农业科技有限公司、杭州百盛精准农业有限公司和浙江启美生态农业有限公司等蝴蝶兰种植基地分别采集数十个蝴蝶兰黑头病样品，对茎基部的典型病斑用蔡氏光学显微镜AX10镜检，并保存备用。

1.2 病原的分离纯化

采集黑头病的典型病样，并用组织分离方法进行分离纯化。病健组织切成5 mm×5 mm的小块，并用70%乙醇消毒40 s，用无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干水分后，置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于25 ℃霉菌培养箱黑暗培养5 d。将获得的不同菌落的菌丝块置于新的PDA培养基进行单独培养。培养至产孢后，单孢纯化获得不同菌株，并保存备用。

1.3 致病性测定

将获得的不同分离菌株在PDA培养基上培养5 d后，用5 mm打孔器从菌落边缘打出菌碟，避开叶片主脉放置在健康的蝴蝶兰品种LL29叶片上(4～5片叶)。以PDA培养基空白块为对照，保湿48 h，于25 ℃光照培养箱(12 h光照/12 h黑暗)培养，每天观察病斑的形成和症状特征。

1.4 分子鉴定系统性分析

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离物的基因组DNA，核糖体内部转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)扩增通用引物ITS1/ITS4[3]、甘油-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因内含子引物GDF1/GDR1[4]、肌动蛋白(Actin，ACT)引物ACT-512F/ACT-783R[5]、延迟因子(translation elongation factor 1-alpha，TEF)引物EF1-728F/EF1-986R[5]和β微管蛋白(β-tubulin，tub2)引物BT-2a/BT-2b[6]由北京擎科生物有限公司合成。炭疽菌以ITS+Act+GAPDH+Tub的顺序，镰刀菌以ITS+TEF的顺序进行排列，将获得的各基因串联成数据集，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)，利用软件Mega 7.0将分离到的菌株分别与已发表的10个炭疽病菌菌株和18个镰刀菌菌株构建系统发育树，设定Bootstrap为1 000。

1.5 黑头病的品种抗性调查

调查了杭州兰派农业科技有限公司、杭州百盛精准农业有限公司和浙江启美生态农业有限公司等蝴蝶兰种植基地中的21个蝴蝶兰品种的黑头病发生率，筛选出抗性品种。

2 结果与分析

2.1 病原诊断和症状描述

观察蝴蝶兰苗期、抽梗期和开花期的黑头病病症，并对这些病斑进行植物病理学的镜检、组织分离、病原纯化鉴定以及致病性测定后，结果发现黑头病可以细分为2类病症，由不同的病原真菌侵染引起，分别为炭疽类(Colletotrichumsp.)[7]和镰刀类(Fusariumsp.)，即蝴蝶兰黑头病是由炭疽类真菌引起的炭疽病和镰刀菌类真菌引起的枯萎病2种病害组成。

炭疽病病斑常在茎基部出现，最初为褪绿或褐色小点，后变为圆形或不规则形黑色病斑，病斑后期变为灰白色，有时有轮纹，病部密生小黑点，湿度高时小黑点可分泌出猩红色黏孢子团，或产生规则排列的白色绒毛状小点。病斑扩展至整个叶柄主脉时叶片发黄或枯死，枯死的老叶正反两面均可见密生小黑点。该病也在叶面上发生，可形成略凹陷的针点状小斑点(图1)。

图1 由虎头兰刺盘孢侵染引起的蝴蝶兰黑头病的田间典型症状

枯萎病初发时病部为水渍状褪绿病斑，后发展成半圆形或不规则形，病斑黑色，略凹陷，病部叶片常发红或发黄。湿度高时，病部可出现白色霉层，发病茎部脆弱，易折断。最后病斑扩展整个叶基部，叶片断裂、脱落，病斑继续向上向下蔓延，直至整株枯死。该症状蝴蝶兰苗期、催花和开花等阶段均可发病(图2)。

图2 由茄病镰孢侵染引起的蝴蝶兰黑头病的田间典型症状

2.2 病原鉴定

根据蝴蝶兰苗期、抽梗期和开花期发生的黑头病病症，我们发现黑头病由炭疽类和镰刀菌类2种病原真菌侵染形成。这2种病害症状和发生条件都非常相似，较难分辨。采用组织分离法从这2种蝴蝶兰病样中分离获得数十个不同的分离物菌株。将这些分离物置于新鲜PDA培养基上于25 ℃黑暗培养。

炭疽类病原菌呈放射状生长，初生菌丝白色，短绒毛状，后变深橄榄色至黑灰色。该菌在PDA固体培养基上不易产孢，在液体PDA中25 ℃培养5 d可产生少量分生孢子。分生孢子透明，杆形，14.3～19.8 μm×5.0～5.4 μm。在寄主植物上可产生大量近球形黑色孢子器，嵌于叶组织内，具一个孔口，有的有刚毛。有性形态子囊孢子，杆状，单孢，透明，1～2个油球，或油球不明显。从菌落形态上初步判断为虎头兰刺盘孢[7]。

镰刀菌类在培养基上呈放射状生长，白色绒毛状，菌落背面为土黄色；产生大量的卵形小型分生孢子，8.0～16.0 μm×2.5～4.0 μm，以及少量马特型大型分生孢子，两端较钝，基部细胞有足跟，3～5隔，23.1～58.4 μm×3.0～6.0 μm。根据菌落形态初步判断为茄病镰孢[8]。

2.3 致病性测定

将2种病原分离物培养5 d后接种至健康的蝴蝶兰植株上，接种4 d后2种分离物的接种处均产生病斑。炭疽类分离物接种后产生的病斑为深褐色，病健交界清晰，有少许黄晕，病斑略凹陷，有时有轮纹。茄病镰刀菌分离物接种后最初产生水浸状淡褐色病斑，后期病斑颜色略变深，随着病斑的扩展，病健交界模糊，周围叶肉或整个叶片明显变黄或变红。这2种病原分离物对蝴蝶兰均有较强的致病性。而对照植株无病斑。根据柯赫氏法则，从接种部位重新分离出了对应的相同病原物，因此，确认这2种病原分别为蝴蝶兰黑头病的2种病原菌(图3)。

A—虎头兰刺盘孢接种后7 d；B—茄病镰孢接种后7 d；C—空白对照。

2.4 蝴蝶兰黑头病的分子鉴定

使用Mega 7.0软件，采用邻接法拼接序列，将典型病原菌菌株的ITS rDNA基因、肌动蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(Tub)和甘油磷酸脱氢酶基因(GAPDH)序列和翻译延长因子(TEF)与GenBank中的Colletotrichum属和Fusarium属菌株构建了系统发育树(图4)，分别以C.gloeosporioidesCBS112999和GibberellazeaeNRRL 29169为外组，结果表明，炭疽类菌株与已报道的盘长孢状刺盘孢C.orchidearum类群构成了明显的分支，并且相似性达到99%，镰刀类菌株与F.solani类聚，且相似性达到了98%。

图4 虎头兰刺盘孢和茄病镰孢的序列进化树

因此，根据形态和分子鉴定结果，确诊造成蝴蝶兰黑头病的炭疽类病原菌为虎头兰刺盘孢(ColletotrichumorchidearumAlleschf.Cymbidii Allesch)[9]，造成蝴蝶兰黑头病的镰刀类病原菌为茄病镰孢(Fusariumsolanif.sp.Fabae Yu et C.T.Feng)。

3 虎头兰刺盘孢和茄病镰孢引起的蝴蝶兰黑头病的发生率

从杭州兰派农业科技有限公司、杭州百盛精准农业有限公司和浙江启美生态农业有限公司等蝴蝶兰基地分别采集黑头病样品数十份，镜检并分离培养病原物。发现由C.orchidearum引起的黑头病发生率最大，为62.5%以上，而由F.solani引起的黑头病的发生率在14.8%～37.5%(表1)。其中F.solani引起的黑头病主要发生在蝴蝶兰苗期，其发生的比例明显高于成株期。个别样品的病斑则由其他病原引起，还有待进一步验证。

表1 虎头兰刺盘孢和茄病镰孢引起的蝴蝶兰黑头病的发生率

4 蝴蝶兰品种对黑头病的抗性差异

2021年11月，随机调查了21个蝴蝶兰品种的黑头病发生情况(表2)，发现5个大花型中，金橘、仙桃、富乐夕阳的发病率为0，无黑头病，为抗性品种。而16个中小花型中仅红粉佳人、雪玉未发生黑头病，其余品种均有不同程度的病害发生。

表2 蝴蝶兰品种黑头病发现情况调查

5 蝴蝶兰黑头病的发生流行规律

在温室大棚内，由虎头兰刺盘孢和茄病镰孢引起的蝴蝶兰黑头病具有相似的发生和流行规律，其主要以菌丝体和分生孢子器在病原组织内越冬，经农事操作和水滴气流的传播扩散。在蝴蝶兰整个生产过程均可发病，植株在伤口、高温高湿、浇水过量或当头淋浇、排水通风不畅等情况下容易被诱发。

蝴蝶兰黑头病中，由虎头兰刺盘孢侵染引起的炭疽类黑头病占多数，由茄病镰孢引起的镰刀类黑头病占小部分。虎头兰刺盘孢以伤口侵入为主，具有较长时间的潜伏期，周年发病。可从气生根或花梗抽出在叶柄上形成伤口入侵，为病害发生高峰期，该时期为预防炭疽病的关键时期。茄病镰孢从肉质根系或伤口侵入，植株长势弱、基质带菌和通风排水不畅等情况下易诱发病害，以苗期发病为主。蝴蝶兰黑头病3—10月均可发生，春秋季棚内温湿度高，为黑头病发生的主要时期，提早做好病害的预防，控温通气，降低棚内湿度，是防控病害的关键。

6 蝴蝶兰黑头病的综合防治技术

6.1 选用抗病品种

从杭州市3家蝴蝶兰生产企业调查情况看，目前生产上常用的蝴蝶兰品种中易感品种为双色鸟、三色鸟、甜格格、LL29、大黄蜂、明日之星等，在生产中需谨慎使用。

6.2 把好基质和种植关

基质材料需充分消毒灭菌，减少病原菌的携带。蝴蝶兰小苗换盆时要浅栽，裸露茎基，基质切勿没过植株茎基部。

6.3 正确浇水和通风

换盆后一个月内应控制水分，养护过程忌大水漫灌，或从当头灌浇，需从花盆边缘浇入。选择晴天浇水，每次浇透水后打开风扇增加空气流通，降低局部湿度。

6.4 及时清理病源

平时加强巡园，及时清除植株上的老叶、病叶、枯枝、冻害或灼伤的叶片，隔离或清除传染源。发现病叶应剪除，在伤口涂抹杀菌剂。若发病严重时，则整株清除。

6.5 合理施肥和温湿度管理

施肥遵循“少量多次、薄肥勤施”的原则，出瓶后5～7个月适当降低氮肥比例，催花前1个月开始提高磷钾比例；苗期温度26～30 ℃，催花期温度18～25 ℃；湿度60%～80%为宜，环境湿度达到90%以上时，开启内循环，加强空气流动。

6.6 减少伤口产生

装箱前需控水，防止因基质过湿引起纸箱潮湿变软，造成纸箱塌陷，压伤植株。在运输过程中需轻拿轻放，防止出现大量伤口。

6.7 适时化学防治

以防为主。换盆前后喷洒广谱性杀菌剂，第一次浇灌肥水可与广谱性杀菌药物同时施用，如亮盾(精甲·咯菌腈)悬浮种衣剂2 000倍液，之后每2周喷施1次广谱性杀菌剂；抽梗时蝴蝶兰茎基部产生较大伤口，易感品种在长出花梗过程中易出现发病高峰期，催花前后为防控关键期，可用450 g·L-1咪鲜胺微乳剂1 000倍液、30%吡唑醚菌酯乳油2 000倍液、25%苯醚溴菌清可湿性粉剂600倍液中的1～2种药剂，5～7 d喷1次，连喷3次。各种药剂要交替使用，以防病菌产生抗药性。换盆或运输兰株前后可喷药1次，进行预防。