激素和天然添加物对大籽雪胆生根的影响

字胡润，赵艳娟，苏娟，符雨帆，管世超，文凤，李靖瑞，岳健，*

(1.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650506；2.云南山里红生物科技有限公司，云南 昆明 650229)

雪胆是雪胆属(HemsleyaCogn.)葫芦科(Cucurbitaceae)植物的块茎，主要分布在我国西南部至中南部，是多年生攀援草本，其块茎可入药。雪胆属植物共有31个种，其中包括大籽雪胆(Hemsleyamacrosperma)、中华雪胆(Hemsleyachinensis)、蛇莲(Hemsleyasphaerocarpa)和浙江雪胆(Hemsleyazhejiangensis)等种类[1]，本实验以大籽雪胆(H.macrosperma)幼苗作为实验材料，大籽雪胆又名罗锅底、苦金盆，块根膨大成扁圆形，多在温暖、阴湿处生长，是被记载的云南民间传统用药。

雪胆含有的药用活性成分主要包括雪胆甲素、雪胆乙素、竹节参皂苷(IVA)和齐墩果酸等，具有抗菌、抗炎和抗癌等功效[2-3]，在防治胃十二指肠溃疡[4]、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)等方面有良好表现[5]，现有研究初步证明了雪胆药用成分广泛的应用前景。

中成药雪胆素片和雪胆素胶囊等都以雪胆作为原材料生产，除疗效良好外，服用剂量和副作用较小，是云南的特色中药制剂[6]。传统医药雪胆素片与现代医学结合产生了广阔的医疗前景，雪胆素片联合阿霉素使用能有效增强细胞免疫原性死亡从而有抗肝癌作用[7]。临床研究[8]发现，雪胆素片与盐酸依匹斯汀胶囊联合使用，对治疗慢性荨麻疹有较好疗效。

随着对雪胆药用效果的进一步深入研究，近年来市场对雪胆的需求量不断增加，但因为雪胆属植物自然生长较慢且繁殖系数较低，传统种植主要是通过种子和块茎切段繁殖，种生苗和实生苗都需要生长2 a左右才能移植到大田中栽培，4～5 a后收获[9]。同时，雪胆属植物的野生资源较少，难以满足日益增长的需求，过度开发给自然生态资源保护带来了压力。所以，经组织培养技术快速繁殖后，再进行人工栽培成为大量生产雪胆的有效技术[10]。在对浙江雪胆的组织培养研究中发现，不同质量浓度的α-萘乙酸(NAA)与细胞分裂素(6-BA)对其生长发育影响较大，且二者混配对提高繁殖系数有积极作用[8]。在对峨眉雪胆组织培养体系的研究中发现，最佳外植体和诱导培养基组合是叶片和基础培养基(MS)+1.0 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA[11]。此外，对于雪胆组织培养技术的探索较少，因此，对雪胆培养基进一步研究是后续产业化生产雪胆的重要基础。

在实际生产中，大籽雪胆幼苗在前期组织培养中易出现根部膨大明显成块状，无有效根的问题，直接影响后续大籽雪胆幼苗的生长发育。因此，设计含不同浓度激素及不同含量天然添加物的培养基进行试验，以大籽雪胆幼苗的根长势正常(不膨大)且每棵苗有3条有效根为优化合格指标，为解决大籽雪胆幼苗在组培中的质量和生长问题及探究最适宜的雪胆苗培养基提供了试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

云南青谷生物科技有限公司生产培养室苗龄为30 d的大籽雪胆生根苗，长势正常，叶片为绿色，根的长势正常，成条状。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制备

每个配方配制1 L培养基，每瓶灌装50 mL，培养基的pH值为6.0，灌装好后放入灭菌锅内，压力为0.12 MPa，温度保持在122 ℃，灭菌30 min后取出培养基放入预培养室培养5～7 d，选取稳定无污染的培养基进行试验。

1.2.2 接种方法

在超净工作台内，用灭菌的手术剪将培育30 d健康的大籽雪胆幼苗剪成茎段，每个茎段包含1个芽点，将茎段接种至制备好的培养基中。

1.2.3 激素及香蕉粉添加物的含量对雪胆生根的影响

雪胆属植物培养所用的生长调节剂NAA的浓度和比例均有所不同，NAA含量会直接影响根的生长[10]，在培养基中不同含量的天然添加物也会影响雪胆生根。本研究以MS为对照，以NAA、香蕉粉浓度和活性炭为变量，设置不同处理(表1)，每个处理各5瓶50 mL的培养基，每瓶转接12个含1个芽点的茎段，重复4次。培养30 d后，统计根部膨大、生根及苗的生长情况，调查平均根部膨大直径、生根率、有效根数和苗高。

表1 处理组及对照组培养基各组分含量

1.2.4 培养条件

大籽雪胆幼苗培养室的条件为光照2 500 lx、湿度30%左右、温度(21±3)℃。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NAA对大籽雪胆幼苗生根的影响

在培养30 d后，不同浓度的NAA对大籽雪胆幼苗的影响见表2。由第5组、第7组及第8组和对照组数据可知，大籽雪胆幼苗的生根率和有效根数随着NAA浓度的增加而提高，在NAA浓度为0.5 mL·L-1时生根率最高，有效根数高达8.0条。由第6组、第8组和对照组来看，雪胆根部的异常膨大与激素NAA的添加关系不大，与活性炭的添加关系较大。但在第8组中，在添加活性炭的情况下，大籽雪胆幼苗根部仍然出现了先膨大再长根的异常情况，所以其根部的膨大可能与NAA和活性炭的比例有关系。

表2 激素和天然添加物对大籽雪胆幼苗生根的影响

同时，在培养30 d后对大籽雪胆幼苗的株高和颜色的观察中发现，添加不同激素NAA对雪胆幼苗上半部分生长影响不大，雪胆幼苗株高均在7.60 cm以上。实验结果表明，活性炭明显影响大籽雪胆幼苗上半部分的生长，未添加活性炭的处理在30 d生长状况与对照组幼苗情况相似，幼苗都较矮，且叶片颜色偏黄(图1)。

图1 转接30 d后大籽雪胆幼苗生长状况

2.2 香蕉粉含量对大籽雪胆幼苗生根的影响

在MS基础培养基中，用香蕉粉代替激素NAA和吲哚丁酸(IBA)进行组织培养，30 d后进行观察统计，不同浓度的香蕉粉对大籽雪胆幼苗的影响见表2。在有活性炭添加的情况下，添加香蕉粉对雪胆幼苗生根有促进作用，添加0.3 g·L-1香蕉粉时，雪胆幼苗的生根状况最好，生根率高达96.3%，有效根条数为4.2条。第3组未添加活性炭处理组的雪胆幼苗出现了与对照组相同的根部异常膨大的情况，这表明香蕉粉的添加对大籽雪胆幼苗的根部膨大没有影响。并且，香蕉粉的添加量不同对雪胆幼苗的上半部分的生长影响并不大，添加不同浓度的香蕉粉，培养30 d时雪胆幼苗的株高均在8.00 cm以上。然而，在未添加活性炭的组别中，幼苗的后续生长严重受阻，苗高较低，且叶色偏黄，和添加NAA处理中未添加活性炭及对照组的2个处理组结果相似，所以活性炭有无可能是导致大籽雪胆幼苗根部是否异常膨大的关键因素之一。

3 结论与讨论

许多研究[12-13]报道了雪胆苗培养基配方，以及在组织培养中香蕉粉的添加有益于植物生长，唐军荣等[14]研究发现，在金线莲组培培养基中添加香蕉粉有壮苗效果，陈志等[15]研究发现，在铁皮石斛培养中添加香蕉粉可促进种苗生长，并且可以规避因香蕉成熟度不一而导致的种苗质量不一，同时还可以降低实际生产的成本。本试验采用全量MS培养基为基础培养基，大籽雪胆幼苗的生根率和有效根数随着NAA浓度的增加而提高，雪胆幼苗株高均在7.60 cm以上。然而，在用香蕉粉代替激素NAA和IBA，添加0.3 g·L-1活性炭时，雪胆幼苗生根及生长情况最好，幼苗的生根率达到96.3%，有效根条数为4.2条，根部正常发育成条状，不出现异常膨大，同时，添加了不同浓度的香蕉粉后，雪胆幼苗的株高均在8.00 cm以上，是较为适宜的培养基配方，初步解决了大籽雪胆幼苗在生产中发生根部膨大，幼苗发育不正常的问题。大籽雪胆幼苗根部膨大与香蕉粉的添加无关，而是与活性炭以及活性炭和NAA的比例有关，为后续进一步优化培养基配方和大籽雪胆幼苗的规模化生产提供了重要的依据。

先前研究[16-18]中明确了活性炭在组织培养中的积极作用，如在防治褐化、调节培养基激素比例、清除培养基中有害物质和促进生根等方面有良好作用，这可能与活性炭的强吸附作用有关。本试验同样发现，活性炭在大籽雪胆幼苗的组织培养中具有积极作用，能有效解决大籽雪胆幼苗在组织培养中根部膨大的问题，但对培养基中最优的活性炭添加量仍然缺少研究。在本试验第8组中，添加了适量活性炭的情况下，仍然由于NAA含量的升高，出现了大籽雪胆幼苗根部膨大的情况，猜测可能是因为NAA的高浓度，导致活性炭的吸附作用无法发挥，这与前人研究[19]中所报道在培养基中活性炭对生长调节物质的吸附有所联系，但NAA和活性炭二者在培养基里的最优比例关系，及活性炭在雪胆苗组织培养中调节根部膨大的具体机制仍然需要进一步探索。

在组织培养中，对雪胆属植物最优培养基的探索是符合市场需要和发展的必然需求，但现有文献报道较少，仅有在浙江雪胆(H.zhejiangensis)和蛇莲(H.sphaerocarpa)等有部分研究，在最适培养基、最佳激素添加种类和最优天然添加物等方面仍然有待研究。本试验以较少文献报道的大籽雪胆作为研究材料，为探究最适宜的大籽雪胆幼苗生长培养基、解决实际生产中出现的大籽幼苗根部膨大问题、提高大籽雪胆幼苗的质量和规模化生产雪胆提供了重要依据，为雪胆进一步的生产应用和野生资源的保护奠定基础。