不同剂量率辐射对水稻诱变效应的影响

陆艳婷，杨文新，刘超纲，俞法明，叶靖，陈金跃，王炳奎

(浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021)

电离辐射能量可使生物体各种分子发生电离和激发，这些分子通过一系列反应产生活泼的自由原子和自由基，再与大分子物质如核酸、蛋白质和酶等发生反应，引起分子结构的变化，导致生物体正常生化过程受到干扰，引发DNA碱基改变、各种细胞器的结构及其组成变化，产生基因突变，从而产生新的性状或变异体。γ射线具有波长短、频率高、能量高的特点，穿透力强，可使生物体内细胞发生电离作用。

水稻的种植面积和产量分别占世界作物生产的1/5和1/4，是重要的粮食作物。好的品种对于水稻生产十分重要，种质资源是水稻育种的关键，有效地开发和利用水稻种质资源，才有可能取得品种的遗传改良和育种的突破。近年来审定的品种较多，但同类型品种间的遗传距离狭窄、遗传差异相对较小[1-4]，成为水稻育种难以取得突破性进展的原因之一。辐射诱发突变创制新种质是解决这些问题的重要途径之一。不同剂量的60Co-γ射线、重离子、UV-C等对农作物的诱变效应已有报道[5-9]，但至今未见137Cs-γ射线的不同剂量率辐射对水稻诱变效应影响的相关报道。本试验以水稻种子为材料，开展了137Cs-γ射线的不同剂量率和不同剂量的辐射处理，以了解水稻种子对不同剂量率和不同剂量137Cs-γ射线辐射的敏感性和生理响应，探究不同剂量率和不同剂量对水稻诱变效应的影响，为水稻辐射诱变中提高有效诱变率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用的水稻品种为籼型水稻浙1613和粳型水稻浙粳100，籼型水稻浙1613种子含水量小于13.5%，粳型水稻浙粳100种子含水量小于14.5%，符合国家贮藏标准。

1.2 辐射剂量率与剂量设计

辐射处理在浙江省农业科学院国家水稻改良中心辐射育种研究室(浙江省辐照中心)进行，放射源为137Cs；处理剂量率分别为10、60、250 Gy·h-1；剂量分别为150、250、350、400、450 Gy。用于测序的400 Gy不同剂量率各处理的种子量为100 g，其他各处理种子50 g，以无辐射处理(即0 Gy)为对照，剂量计与样品并排排列，3次重复。

1.3 发芽试验

试验于2021—2022年在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所核技术利用研究室进行。取12 cm×12 cm实验用种子发芽盒，底部放入3张滤纸，加入40 mL纯净水，每处理随机选取饱满的100粒水稻种子均匀放至各发芽盒中，种子之间保持足够的距离，以保证种子都能充分接触水分，吸水一致，生长良好，每处理设3次重复，随机排列。在实验过程中随时检查，保持滤纸湿润。发芽盒放入植物生长箱(型号：Binder KBW400；德国宾德有限责任公司)培养，设定温度(30±2)℃。2 d时将已萌发(可见芽和根)的种子转入96孔水培盒。培养液浓度为463.9 mg·L-1的Yoshida水稻营养液(干粉)，pH值为5.8±0.1，水培盒每5 d更换1次营养液。

1.4 成苗率与苗高

7 d时统计发芽率，21 d时统计成苗率。只长芽不发根或只发根不长芽的种子剔除。从每个种植箱内随机选取除四周位置外的10株幼苗跟踪测量7、21 d时苗高、根长，并计数21 d的总根数。

1.5 基因测序

各取不同剂量率的400 Gy辐射处理的2 000株7 d时的幼苗等量叶片混合提取DNA，以不辐照为对照，委托北京诺禾致源科技股份有限公司测序。DNA样品经电泳检测后通过Covaris破碎机随机打断为长度为350 bp的片段，构建的文库通过illumina HiSeqTMPE150进行测序。3个不同剂量率处理及对照测序平均深度在(36.21～39.39)×，为了保证数据质量，对测序得到的原始序列中含有带接头的、低质量的信息进行过滤，然后将过滤后的有效测序数据比对到R498参考基因组(http：//mbkbase.org)，比对结果去重复后进行统计分析。

1.6 数据分析

用SPSS和Excel软件进行所有数据的统计分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 辐射剂量测量

对辐射的实际剂量进行测定，不同剂量率下不同预设剂量的实测标准差在1.6～4.4 Gy，符合试验要求(表1)。

表1 辐照处理的剂量测定

2.2 不同剂量率辐射对水稻发芽率和成苗率的影响

由表2可见，不同辐射剂量处理对供试材料的发芽率和成苗率有明显影响，随着辐射剂量的增加，浙1613和浙粳100的种子发芽率和成苗率均下降。同一剂量处理下，不同剂量率辐射对浙1613的7 d发芽率没有显著影响；浙粳100在350、450 Gy辐射剂量处理时，不同剂量率下发芽率有显著差异。250、350、450 Gy辐射剂量处理下，浙粳100的21 d成苗率有显著差异。结果表明，较低剂量下不同剂量率辐射对成苗率没有影响，但较高剂量处理时不同剂量率对成苗率有显著影响。

表2 不同剂量率辐照对水稻成苗率的影响

2.3 不同剂量率辐射对水稻幼苗苗高的影响

对2个水稻品种在不同辐射条件处理后的苗高进行测量，发现辐射处理抑制幼苗生长，且随剂量增大抑制更加明显(图1)。浙1613经10、60、250 Gy·h-1不同剂量率下的350 Gy辐射处理的21 d苗高分别为14.6、15.2、15.9 cm，较对照分别降低12.05%、8.43%、4.22%，10 Gy·h-1的低剂量率处理的苗高显著低于250 Gy·h-1高剂量率处理的苗高；450 Gy的不同剂量率处理的苗高差异显著性情况与350 Gy相一致。浙粳100在250、350 Gy辐射条件下，250 Gy·h-1处理的21 d苗高均显著高于10 Gy·h-1处理，10、60、250 Gy·h-1剂量率的450 Gy辐射处理的21 d苗高分别为4.4、4.7、5.2 cm，较对照分别降低51.11%、47.77%、42.22%，250 Gy·h-1处理的21 d苗高显著高于10、60 Gy·h-1处理。

同剂量不同剂量率柱子上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表3可见，不同辐射剂量对水稻根系生长影响显著。随着辐射剂量的增加，水稻根长降低，总根数随之减少，品种间降幅略有差异，辐射处理明显抑制幼苗的根系生长，且随辐射剂量增大抑制更加明显。与苗高的变化趋势相似，较高辐射剂量处理时，高剂量率的处理根长和根系数均要高于低剂量率的。在450 Gy剂量处理下，浙粳100在高剂量率处理组的根长与根数高于低剂量率处理。

表3 同一剂量不同剂量率辐射对水稻根系生长的影响

2.4 高剂量辐射下不同剂量率对水稻农艺性状的影响

高剂量辐射处理影响种子苗床成苗率、大田成活率和结实率。如表4所示，10、60、250 Gy·h-1不同剂量率下450 Gy辐射处理对浙1613和浙粳100的苗床成苗率、大田成活率和株高的影响明显。450 Gy辐射处理下的不同剂量率处理对浙1613的分蘖数、有效穗、穗长影响不明显，而对浙粳100影响较大。450 Gy高剂量辐射处理明显降低水稻的实粒数、总粒数和结实率。剂量率越高，浙1613的每穗实粒数下降越显著，而浙粳100在各剂量率下的影响都特别明显。浙1613的总粒数在3个不同剂量率下差异不明显，但浙粳100在3个不同剂量率之间差异较大。不同剂量率对结实率的影响与实粒数相一致。株高是重要的植物形态学指标，较高剂量辐射下水稻受影响较为明显，3个不同剂量率的水稻成株后株高均下降，且浙粳100受影响较大。

表4 高剂量条件下不同剂量率辐射对水稻生长的影响

2.5 不同剂量率的辐射对基因组诱变程度的影响

3个不同剂量率处理对水稻种子发芽率影响不显著，但对水稻后期生长造成一定的影响。为评估不同剂量率的辐射对基因组诱发突变程度的影响，对3个不同剂量率400 Gy辐射处理的浙1613全基因组测序，评估发生变异的概率。

通常认为变异位于外显子区域或剪接位点可能会引起功能变异，根据全基因组InDel和SNP变异检测结果，10、60、250 Gy·h-1剂量率处理的样品获得标记的个数分别为1 140 624个(其中，Indel为174 813个，SNP为965 811个)、1 141 426个(其中，Indel为174 365个，SNP为967 061个)和1 139 980个(其中，Indel为174 292个，SNP为965 688个)。与对照比对发现存在变异的位点分别为75 262个(其中，Indel为27 183个，SNP为48 079个)、77 143个(其中，Indel为27 315个，SNP为49 828个)和81 056个(其中，Indel为28 015个，SNP为53 041个)，其中，位于外显子区域或可变剪接位点的变异分别为2 869(其中，Indel为514个，SNP为2 355个)、3 010个(其中，Indel为505个、SNP为2 505个)、和3 363个(其中，Indel为540个，SNP为2 823个)，分别占总变异位点的3.81%、3.90%、4.15%，占总位点的0.25%、0.26%、0.30%，即3个不同剂量率处理后可能发生变异的概率分别为0.25%、0.26%、0.30%，表明不同剂量率处理诱发的基因组变异存在差异(图2)，且随剂量率的增加而增加。

图2 不同剂量率处理对水稻幼苗全基因组可能变异的概率估算

3 小结与讨论

当前，种业“卡脖子”技术受到党和国家领导人及学术界的高度重视，也受到浙江省政府以及省内外种业和农学界高度重视[10-11]，如何突破种业“卡脖子”技术，需要在育种技术上积极探索。水稻的自然变异率约二十万分之一，长期以来的实践表明，辐射诱变的变异率可达千分之几，这与本试验根据全基因测序估算的3个不同剂量率间的可能变异率在0.25%～0.30%相吻合，说明辐射处理可以在相对较短的时间内培育出特异的种质资源，辐射诱变育种是作物育种取得突破的重要途径之一[1，12-13]，因此，有必要对各种作物种子的辐射诱变效应进行系统研究。

全基因测序可以评估辐射诱导基因组发生变异的概率。林兆松等[13]认为籼稻的半致死剂量为350～450 Gy，因此，本试验设置400 Gy辐射剂量来开展10、60、250 Gy·h-13个不同剂量率的试验，以评估在半致死剂量水平上不同剂量率对全基因组发生变异概率的影响。测序结果显示，不同剂量率对于DNA的碱基插入、缺失等影响未达到显著水平，但变异概率仍有比较明显的差异。γ辐照导致的碱基排列差异直接导致基因的改变，从而导致性状的改变。相同剂量下，较低剂量率处理意味着辐射处理的时间延长，植株成株后株高较低，而高剂量辐射采用低剂量率处理也无明显的负面效应；高剂量率处理时间短，植株结实率较低，变异率较高。因此，实际操作中可根据实际情况选择高剂量率或低剂量率。目前，科技部已经推出“主要农作物种质定向诱变技术”重大专项研究。在进行不同剂量对水稻不同品种类型辐射诱变效应研究的基础上，开展不同剂量率的诱变效应研究，结合基因组学的方法进行评估，可以深入地了解γ射线辐射的诱变效应机理，为辐射诱变提供更多支撑。

本研究表明，137Cs-γ射线对水稻种子具有较强的诱变效应，不同遗传背景的品种之间对辐射敏感性表现出一定的差异。较高剂量辐射下，低剂量率(10 Gy·h-1)的处理，对浙1613和浙粳100水稻种子的成苗率影响显著；350 Gy和450Gy较高剂量处理，剂量率为250 Gy·h-1的浙1613和浙粳100苗高均高于10和60 Gy·h-1处理；450 Gy辐射剂量处理下，60和250 Gy·h-1处理的浙粳100根长与根数高于10 Gy·h-1处理。较高剂量下，低剂量率处理对2个品种的株高影响更明显，但高剂量率对结实率影响更大。全基因测序评估可能变异率结果显示，不同剂量率处理诱发的基因组变异存在差异，且随剂量率增加而增加。

总之，在较高剂量辐射处理后，低剂量率与高剂量率间的辐射效应差异较大。结合形态学与基因组学研究，发现较高剂量辐射下，低剂量率处理水稻成株后株高下降，高剂量率处理结实率大幅下降，变异概率增加。这些结果对于进一步提升水稻辐射诱变育种技术，为新品种的繁育提供更为丰富的突变材料具有积极的意义。