哮喘宁颗粒干预心理应激哮喘大鼠应激状态及肺通气功能作用机制研究

李长安,崔红生,班承钧

(1.北京中医药大学东直门医院,北京 100700;2.北京中医药大学第三附属医院,北京 100029)

支气管哮喘是由多种炎性细胞引起的慢性气道炎症性疾病,其患病率、病死率与心理应激、情志等密切相关[1]。精神障碍,尤其是焦虑和抑郁,在哮喘患者中普遍存在,并与哮喘控制不佳、药物依从性差、生活质量差相关[2-3]。对于伴有焦虑或抑郁症的哮喘患者,现无有效的药物和非药物治疗方法,认知行为治疗、身心疗法、放松疗法和生物反馈疗法在临床均未取得满意疗效。

情志与哮喘关系密切,情志不遂可促使哮喘的发生、发展;而哮喘得不到有效控制则易引起心理疾病;两者互为因果,形成恶性循环,促进疾病进展。肝主疏泄功能在机体心理应激中起着决定性的作用。武维屏等[4]认为,气郁、气逆是哮喘发病之中心环节,气郁不解,气逆不降,哮喘难平。因此,调肝理肺、理气降逆为治疗哮喘重要法则,哮喘宁颗粒组方严谨,调肝与理肺并行,临床疗效显著,在防治心理因素所诱发的哮喘方面具有极大的优势。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SPF级雄性SD大鼠,鼠龄4～5周,体重(120±10)g,动物许可证号:SCXK(京)2020-0001,购自维通利华实验动物技术有限公司。室温(22±1)℃,空气湿度40%～50%,予常规饲料及饮用水,实验环境安静舒适;本研究经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审核通过,伦理批号:BUCM-4-2020122303-4150。

1.1.2 实验试剂与仪器:卵蛋白(批号A5503-5G,Sigma公司);氢氧化铝佐剂(批号PI77161,Thermo scientific公司);戊巴比妥钠(批号57-33-0,Sigma公司)。自制60 cm×60 cm×40 cm玻璃雾化箱(北京有机玻璃厂);可调式多孔束缚筒(型号JNT-GQ5,冀诺泰公司);空气压缩雾化吸入器(型号NE-C900,欧姆龙);动物肺功能检测仪(AniRes动物肺功能分析系统,北京中医药大学科研实验中心提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 药物制备:①哮喘宁颗粒(京药制字Z20053078,规格12 g/袋),药物组成:柴胡、黄芩、清半夏、白芍、葶苈子、前胡各10 g,地龙、钩藤、全瓜蒌、丹参各15 g,炙麻黄、防风各6 g,由北京中医药大学东直门医院制剂室生产。用法:1袋/次,2次/d,口服。②吸入用布地奈德混悬液(批准文号H20140474,规格1 mg/2 ml),2 mg/次,2次/d,雾化吸入。要求所有实验用药皆用同一批号药物。参考《药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》[5]计算出大鼠哮喘宁颗粒用药剂量为2.18 g/(kg·d),普米克令舒用药剂量为363.11 μg/(kg·d)。

1.2.2 动物分组与给药:将32只大鼠适应性喂养3 d后,采用随机数字表法将大鼠分为正常组、应激哮喘组、普米克令舒组及哮喘宁组,每组8只。参考文献制备[6-8]心理应激哮喘大鼠模型;为避免各组大鼠因给药途径不同所引起的躯体应激反应的差异,故从实验第15天开始每组大鼠每日激发前2 h采取灌胃和雾化吸入方式给药。①应激哮喘组:于实验第1天大鼠腹腔注射含卵蛋白、氢氧化铝佐剂的混合液1 ml致敏。2周后每日雾化吸入1%OVA(流量2 ml/min)20 min激发哮喘,连续14 d。从实验第1天开始将大鼠置入束缚筒内束缚制动1次,要求动物无身体的挤压和疼痛感,能从仰卧位转为俯卧位,但头尾不能翻转,束缚期间禁食禁水。每日开始时间及束缚制动的持续时间不同,第1天为2 h,其后每次增加10 min,连续28 d。实验第15天开始每日激发前2 h均予0.9%氯化钠溶液灌胃和雾化吸入。②普米克令舒组:在心理应激哮喘大鼠模型的基础上,从实验第15天开始每日激发前2 h给予普米克令舒363.11 μg/kg雾化吸入,1次/d,30 min/次,连续14 d;同时每日给予0.9%氯化钠溶液灌胃。③哮喘宁组:在心理应激哮喘大鼠模型的基础上,从实验第15天开始每日激发前2 h给予哮喘宁颗粒2.18 g/kg灌胃,1次/d,连续14 d。④正常组:致敏和激发均以0.9%氯化钠溶液代替,但不做束缚刺激。每日激发前2 h均予0.9%氯化钠溶液灌胃和雾化吸入。

1.2.3 各组大鼠宏观表征比较:包括大鼠体重、饮食量及呼吸频率变化等。

1.2.4 各组大鼠行为学变化比较:包括蔗糖水偏嗜实验、悬尾实验、旷野实验等。①蔗糖水偏嗜实验:实验前,训练实验大鼠适应含糖饮水。每笼同时并排放置2个饮水瓶,第1个24 h内,每瓶均装有1%蔗糖水;随后的24 h,1瓶装1%蔗糖水,另1瓶装纯净水。经过24 h禁水禁食后,开始进行蔗糖水偏嗜实验:即同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水,1瓶为1%蔗糖水,1瓶为纯净水,水瓶左、右随机放置,1 h后取走并称重。糖水偏好程度=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。②悬尾实验:操作者握住大鼠的尾根部1/3处,将大鼠头部向下,固定在悬尾实验架上,由两位实验人员进行操作和记录,每只大鼠观察3 min,主要观察大鼠不动时间和挣扎次数。不动时间指大鼠处于完全放松静止不动状态的累积时间。挣扎次数指大鼠由倒挂向上翻转的总次数。③旷野实验:用open-field test法进行测试。自制敞箱,底面为80 cm×80 cm正方形,划分为25等格,箱高40 cm。以大鼠穿越底面块数(四爪均进入的方格方可计数)为水平运动得分,以直立次数(双足离开底面至放下为1次活动)为垂直运动得分。保持环境安静,调节合适光线,每次测试前清洁敞箱,去除异味。分别在造模前、取材前1 d由两位评定者评定大鼠在3 min内的运动情况。

1.2.5 各组大鼠肺通气功能比较:大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,从环状软骨下第2～3个U形透明软骨间切一横形切口,进行气管切开插管,连接动物肺功能仪,并将大鼠放入密封体描箱中进行肺通气功能测定。观察大鼠呼气峰流速(PEF)、呼气中期峰流速(FEF25%～75%)、用力呼气时间(FET)、FEV0.3/FVC、平均吸气气道阻力(Ri)、平均呼气气道阻力(Re)等指标。

1.2.6 各组大鼠肺组织病理学观察:从肺门至肺边缘处横切,取2～3 cm肺标本,进行石蜡包埋和切片,然后进行HE染色,观察支气管和肺组织病理形态。

2 结 果

2.1 各组大鼠宏观表征比较

2.1.1 各组大鼠体重比较:见表1。干预第14、21、28天,应激哮喘组大鼠体重明显低于正常组(均P<0.05);与应激哮喘组比较,哮喘宁组大鼠干预第28天体重增加明显(P<0.05);与普米克令舒组比较,哮喘宁组大鼠干预第28天体重轻度增加,差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠体重比较(g)

2.1.2 各组大鼠饮食量比较:见表2。干预第14天,应激哮喘组大鼠饮食量低于正常组(P<0.05);与应激哮喘组相比较,哮喘宁组干预第21、28天饮食量明显增加(均P<0.05)。

表2 各组大鼠饮食量比较(g)

2.1.3 各组大鼠呼吸频率比较:见表3。在干预第21、28天,应激哮喘组、哮喘宁组、普米克令舒组大鼠激发前、后呼吸频率明显高于正常组(均P<0.05);与应激哮喘组比较,哮喘宁组、普米克令舒组激发前呼吸频率无明显变化(均P>0.05),激发后呼吸频率明显减少(均P<0.05)。

表3 各组大鼠呼吸频率比较(次/min)

2.2 各组大鼠行为学比较

2.2.1 各组大鼠蔗糖水偏嗜实验比较:见表4。在干预第7、22、28天,应激哮喘组大鼠糖水消耗量及糖水偏好程度明显低于正常组(均P<0.05);与应激哮喘组大鼠相比,干预第22、28天,哮喘宁组、普米克令舒组大鼠糖水消耗量及糖水偏好程度明显增高(均P<0.05);干预第28天,哮喘宁组大鼠糖水偏嗜程度高于普米克令舒组(P<0.05)。

表4 各组大鼠蔗糖水偏嗜实验比较

2.2.2 各组大鼠悬尾实验比较:见表5。在干预第28天,应激哮喘组大鼠翻动次数明显低于正常组(P<0.05),应激哮喘组、哮喘宁组、普米克令舒组大鼠静止时间明显高于正常组(均P<0.05);与应激哮喘组比较,哮喘宁组大鼠翻动次数明显增加,静止时间明显增加(均P<0.05)。

表5 各组大鼠悬尾实验比较

2.2.3 各组大鼠旷野实验比较:见表6。在干预第28天,应激哮喘组和普米克令舒组大鼠水平运动、垂直运动得分明显低于正常组(均P<0.05)。与应激哮喘组比较,哮喘宁组小鼠垂直运动得分明显增加(P<0.05)。

表6 各组大鼠旷野实验比较(分)

2.3 各组大鼠肺通气功能指标比较 见表7。干预第28天,应激哮喘组FEF25%～75%、FEV0.3/FVC明显低于正常组,FET、Ri明显高于正常组(均P<0.05);与应激哮喘组比较,哮喘宁组及普米克令舒组大鼠Ri、Re减低(均P<0.05);PEF、FEF25%～75%、FEV0.3/FVC轻度增高,FET轻度减低,但差异无统计学意义(均P>0.05)。

表7 各组大鼠肺通气功能指标比较

2.4 各组大鼠肺组织病理学表现 见图1。正常组大鼠支气管被覆单层柱状上皮,管腔内未见黏液及脱落上皮细胞,管周未见炎细胞浸润,支气管上皮及管壁平滑肌组织未见增生;肺泡间隔未见增宽,无或有少数淋巴细胞浸润。应激哮喘组大鼠可见支气管黏膜上皮杯状细胞增多,管腔内有分泌物,管壁平滑肌增生,管周淋巴细胞呈散在及灶片状浸润,肺泡间隔增宽,有淋巴细胞为主的炎细胞浸润,靠近胸膜处肺泡明显扩张,肺泡间隔变窄断裂,扩张的肺泡融合形成较大的含气囊腔,呈肺气肿改变,肺泡壁毛细血管受压。普米克令舒组大鼠支气管黏膜上皮少见杯状细胞,上皮轻度增生,腔内未见明显分泌物,管壁平滑肌稍增生,管周有散在淋巴细胞浸润,肺泡壁有淋巴细胞为主的炎细胞浸润,病变程度和咳喘宁组类似。哮喘宁组大鼠支气管黏膜上皮杯状细胞较应激哮喘组减少,腔内未见明显分泌物,支气管管壁平滑肌增生,管周有散在淋巴细胞浸润,肺泡间隔增宽,有淋巴细胞为主的炎细胞浸润。

图1 各组大鼠肺组织病理学表现(HE染色,×100)

3 讨 论

哮喘是典型的心身疾病,其发生、发展与情志因素关系密切;全球哮喘防治创议(GINA)指出焦虑及抑郁为哮喘重要并发症,对哮喘控制至关重要。因此,改善哮喘患者焦虑、抑郁水平对于哮喘控制有着重要意义。既往研究表明,慢性心理应激可以较好地模拟情志异常的综合病理过程,慢性心理应激可明显加重哮喘气道炎症[9-10],但尚无有效药物或非药物治疗措施可显著改善气道炎症,减少心理应激哮喘发作[11]。

中医理论认为,“肝主疏泄”功能在机体心理应激反应中起着决定性的作用。肝的疏泄功能正常,则气机调畅,气血调和,心情舒畅,情志和合。反之,若情志失和则肝郁而不达,气血失调,脏腑功能紊乱而产生各种心身疾患[12]。故《素问·举痛论》曰:“百病生于气也”,《丹溪心法》曰:“气血冲和,万病不生,一有怫郁,诸病生焉”。肝肺生理相关,病理相因,支气管哮喘从肝论治既符合中医传统理论,又具有现代医学科学基础,是治疗哮喘的重要治法之一[13]。基于肝主疏泄、肝肺相关理论,武维屏认为肝失疏泄,气机郁滞,肝肺失和为哮喘发作的中心环节,提出调肝理肺法治疗支气管哮喘,并在长期临床实践过程中对其内涵及疗效机制做了全面阐释和系统研究[14-15]。哮喘宁颗粒是调肝理肺法的代表方药,临床疗效较好。既往临床研究表明[16],哮喘宁治疗支气管哮喘的控显率和总有效率分别为63.33%和90.00%。

本研究结果显示哮喘宁颗粒可明显缓解应激哮喘组大鼠呼吸气促及应激状态;哮喘宁组大鼠体重及饮食明显增加。旷野实验、悬尾实验及蔗糖水偏嗜实验是临床研究中评价心理应激的常用行为指标[17]。高宗等[18]通过旷野实验水平运动得分、糖水消耗量等得出半夏厚朴汤对卒中后抑郁大鼠有改善作用;与此相似,本研究结果提示哮喘宁组大鼠水平运动、垂直运动、蔗糖水偏嗜、挣扎次数均明显增加,悬尾实验不动时间明显降低;且随着用药时间的延长,一般在治疗3周后大鼠应激水平可明显改善;提示哮喘宁颗粒可改善模型大鼠心理应激,减轻焦虑、抑郁,随着治疗时间延长,效果可能更加明显。

哮喘为慢性气道炎症性疾病,哮喘发作时气道分泌物增加、气道痉挛,反复发作则气道平滑肌增生,均会导致气道阻力增大,喘憋明显。研究认为,中药方剂可通过抑制炎性通路,减轻炎症细胞在肺组织中的浸润与聚集,从而控制哮喘大鼠气道炎性反应,达到治疗支气管哮喘的目的[19-20]。应激也可导致气道阻力增加,炎性分泌物增多,气道反应性增高,加重哮喘症状[7]。因此缓解应激症状,改善气道阻力,可缓解哮喘症状。本研究结果显示,与应激哮喘组大鼠比较,哮喘宁组及普米克令舒组气道阻力Re、Ri降低,Ri下降更明显,提示哮喘宁颗粒及普米克令舒对气道阻力,特别是中心气道的阻力改善有较好的治疗作用。哮喘宁组及普米克令舒组大鼠FEV0.3/FVC、FEF25%～75%、PEF相较于应激哮喘组轻度升高,提示哮喘宁颗粒及普米克令舒对于模型大鼠小气道的改善作用偏弱。临床研究显示,中医药治疗支气管哮喘可显著改善患者肺功能和通气情况,并降低气道炎症[21];哮喘严重程度与肺通气功能呈明显负相关,与血清炎症水平呈明显正相关[22],这与本研究结果相似。本研究组织病理学观察显示,相较于应激哮喘组,哮喘宁组大鼠肺组织炎症细胞浸润明显减少。

综上所述,哮喘宁颗粒可缓解心理应激哮喘大鼠应激状态,改善气道平滑肌痉挛,降低气道阻力,减轻气道炎症浸润,改善肺通气功能。