祛湿化痰方联合针刺治疗脾虚痰湿型多囊卵巢综合征疗效研究

滕 婧,杨 柳

(1.湖北省中医院,湖北 武汉 430061;2.湖北中医药大学附属医院,湖北 武汉 430061;3.湖北省中医药研究院,湖北 武汉 430074)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种比较常见的女性生殖系统功能异常性疾病[1]。目前在全世界生育期女性中的发病率为5%～20%[2]。PCOS临床表现包括月经先后无定期、月经稀少或闭经、毛发增多、痤疮、体重增加等症状,常伴发高血压、糖尿病等基础疾病[3]。研究提示,PCOS发病机制与炎症反应存在关联,肿瘤坏死因子等炎症指标升高会影响性激素水平,甚至抑制排卵[4-5]。PCOS是导致不孕的常见原因,其中70%无排卵型不孕均由该病引起,对年轻女性的生活及心理状态造成了极大的影响[6]。目前西医多采用促排卵、抗雄激素等药物治疗,能快速改善上述症状,但长时间使用有较多不良反应[7]。《多囊卵巢综合征相关不孕治疗及生育保护共识》[8]认为针刺疗法具有调月经、促排卵作用,可用于治疗PCOS,然而单独使用疗效有限。中医认为痰湿是引起PCOS的重要原因[9],本科室据此拟定祛湿化痰方联合针刺治疗PCOS。微小RNA是体内的一种小分子RNA,其中血清miR-223、miR-181a能调节炎症反应,在肺炎、脓毒血症等多种炎症性疾病中发挥重要作用[10-11],但二者与PCOS的关系尚未报道。因此,本研究拟探讨祛湿化痰方联合针刺治疗脾虚痰湿型PCOS的疗效,通过多因素Logistic回归和ROC曲线分析miR-223、miR-181a对PCOS治疗后能否妊娠的预测价值,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年12月于湖北省中医院就诊的90例PCOS患者,随机分为对照组和观察组,每组45例。对照组平均年龄(29.12±4.18)岁,平均体重指数(23.75±5.31)kg/m2,平均病程(3.37±0.52)年。观察组平均年龄(29.43±4.56)岁,平均体重指数(23.96±5.13)kg/m2,平均病程(3.48±0.56)年。两组年龄、体重指数、病程比较差异无统计学意义(均P>0.05)。所有患者均在知情的情况下参加本研究,并签署知情同意书。本研究已通过医院伦理委员会审批,批准号:HBZY2019-C19-01。西医诊断标准参照《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》[12]制订:①月经稀发、闭经或不规则子宫出血;②存在高雄激素血症;③超声监测无排卵出现,卵巢见多囊样形态,双侧卵巢内卵泡数超过12个或卵巢体积超过10 ml。符合①项及②③中任何一项,即可诊断。中医症候标准参照《中药新药临床研究指导原则》[13]中不孕脾虚痰湿证的诊断标准:①月经量少、稀发或闭经;②食欲不振,腹胀、腹泻,大便黏腻;③带下量多色白,质黏;④体态肥胖、乏力、疲倦;⑤舌淡胖,边有齿痕,苔白腻,脉滑。具有①项及②③④⑤其中两项,即可诊断。病例纳入标准:符合上述西医诊断及中医证型辨证标准;年龄20～40岁;已婚,有正常性生活且未避孕,1年内未妊娠;6个月内无生育要求。排除标准:严重心、肝、肾等脏器功能不全;合并自身免疫性疾病;合并严重的细菌、真菌感染;对本研究药物过敏;合并传染病或精神类疾病;合并其他严重的生殖系统疾病;入组前3个月使用糖皮质激素或性激素类药物。

1.2 治疗方法

1.2.1 对照组:口服炔雌醇环丙孕酮片(达英-35,批号J20140114)口服,每日1次,每次1片。自月经周期第1天开始口服,共服用21 d,后停药7 d,再开始下一周期;无月经周期者任意选择一天开始口服,共服用21 d。治疗3个月经周期。

1.2.2 观察组:在对照组基础上加用祛湿化痰方联合针刺治疗。祛湿化痰方组成:麸炒苍术15 g,姜半夏、茯苓、丹参、皂角刺各12 g,黄芩、黄柏各10 g,陈皮9 g,甘草6 g。由医院制剂室采用全自动煎药机水煎、浓缩至每袋300 ml,每日2次,每次1袋,每月月经干净开始服用。以1个月经周期为1个疗程,共治疗3个疗程。针刺治疗具体如下:取穴以子宫、归来、中极、关元、足三里、三阴交为主穴,配穴包括血海、脾俞、丰隆;针具采用0.25 mm×40 mm华佗牌一次性无菌针灸针,针法严格按照无菌操作要求,采用平补平泻法,进针至皮下一定深度,其中子宫、归来、中极、关元穴的进针角度与水平面呈30°,深度小于1.2 cm,用基本手法得气,以患者能忍受为限。捻针角度为180°～360°,频率为90～120次/min,施针后留针30 min。每周治疗3次,以1个月经周期为1个疗程,共治疗3个疗程。

1.3 观察指标 ①性激素水平:在月经来潮后第3天抽取空腹静脉血5 ml,离心取血清。采用免疫分析仪检测卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、睾酮(Testosterone,T)水平。②卵巢体积:所有患者在治疗前后,均于排卵日采用彩色多普勒超声诊断仪经阴道检查卵巢体积。③中医症候积分:记录患者治疗前后的食欲不振、腹胀、便溏、神疲乏力症状,将病情严重程度分为无、轻、中、重四级,对应分数依次为0、1、2、3分,分值越高提示病情越重。④炎症因子水平:在月经来潮第3天抽取空腹静脉血5 ml,离心取血清。采用酶联免疫试剂盒检测白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、TNF-α水平。准备酶标板,每孔分别滴加25 μl血清和标准品,37 ℃孵育15 min,再滴加100 μl酶底物,反应20 min,加入显色液,避光15 min,最后滴加终止液。将酶标板放入酶标仪中,采用450 nm波长检测溶液吸光度,计算IL-1β、IL-6、TNF-α水平。⑤血清miR-223、miR-181a水平:所有患者在治疗前后,均于月经周期第3天抽取空腹静脉血5 ml,离心10 min,提取上层血清。采用miRNA提取分离试剂盒提取血清中miRNA,采用miRNA的cDNA反转录试剂盒将miRNA反转录为cDNA。根据miRNA荧光定量检测试剂盒说明书配制反转录体系,将配制好的体系放入的实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应程序为:95 ℃加热1 min,进行40个循环,每个循环包括95 ℃变性30 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s;最后72 ℃加热5 min充分反应。引物由上海生物工程公司合成,序列如下。miR-223正向:5’-ACTGTCGACTAAAGTCGGTGAC-3’,反向:5’-GCGTACTACAGCGTAGATG-3’;miR-181a正向:5’-GACGACTCTAGAAGTCGGTC-AG-3’,反向:5’-CAGCCCTACTGAAGGCTAC-3’;内参采用U6基因,正向:5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’,反向:5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-ΔΔCt法计算miR-223、miR-181a的表达量。⑥妊娠率:治疗结束后每3个月随访1次,共随访1年,记录患者治疗后1年内妊娠情况,计算每组妊娠率。

2 结 果

2.1 两组治疗前后性激素水平比较 见表1。治疗前,两组FSH、LH、T水平相比差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后,两组FSH、LH、T水平低于治疗前,且观察组FSH、LH、T水平低于对照组(均P<0.05)。

表1 两组治疗前后性激素水平比较

2.2 两组治疗前后卵巢体积比较 见表2。治疗前,两组患者卵巢体积相比差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,两组卵巢体积小于治疗前,且观察组卵巢体积小于对照组(均P<0.05)。

表2 两组治疗前后卵巢体积比较(cm3)

2.3 两组治疗前后中医症候积分比较 见表3。治疗前,两组食欲不振、腹胀、便溏、神疲乏力症候积分相比差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后,两组患者食欲不振、腹胀、便溏、神疲乏力症候积分低于治疗前,且观察组食欲不振、腹胀、便溏、神疲乏力积分低于对照组(均P<0.05)。

表3 两组治疗前后中医症候积分比较(分)

2.4 两组治疗前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 见表4。治疗前,两组IL-1β、IL-6、TNF-α水平相比差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后,两组IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于治疗前,且观察组IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于对照组(均P<0.05)。

表4 两组治疗前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较(ng/L)

2.5 两组治疗前后miR-223、miR-181a水平比较 见表5。治疗前,两组患者miR-223、miR-181a水平相比差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后,两组miR-223水平低于治疗前,miR-181a水平高于治疗前(均P<0.05);且观察组miR-223水平低于对照组,miR-181a水平高于对照组(均P<0.05)。

表5 两组治疗前后miR-223、miR-181a水平比较

2.6 血清miR-223、miR-181a与炎症因子的相关性分析 见表6。血清miR-223水平与IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相关(P<0.01),血清miR-181a水平与IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈负相关(P<0.01)。

表6 血清miR-223、miR-181a与炎症因子的相关性分析

2.7 两组患者妊娠率比较 1年后随访,观察组21例妊娠,妊娠率为46.67%,对照组11例妊娠,妊娠率为24.44%。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.8 治疗后未妊娠的多因素Logistic回归分析 见表7。以治疗后1年内是否妊娠为因变量,以miR-223、miR-181a、IL-1β、IL-6、TNF-α为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示,miR-223、IL-6为治疗后1年内未妊娠的独立危险因素(OR=2.184,3.180,P<0.01),miR-181a为治疗后未妊娠的独立保护因素(OR=0.268,P<0.01)。

表7 治疗后未妊娠的多因素Logistic回归分析

2.9 血清miR-223、miR-181a水平对治疗后未妊娠的预测价值 见表8(图1)。绘制血清miR-223、miR-181a水平预测治疗后1年内未妊娠的受试者ROC,并计算AUC,结果显示,miR-223、miR-181a及二者联合预测的AUC分别为0.837、0.811、0.934,二者联合预测优于各自单独预测效能(Z=7.168、9.376,P<0.001)。

3 讨 论

PCOS是导致女性不孕的一种常见疾病,目前认为发病机制与机体炎症状态存在密切关联[14-15]。PCOS患者血清存在细胞因子如IL-1β、IL-6以及TNF-α等水平的异常表达,这使得卵巢功能和性激素水平紊乱,抑制卵泡进一步发育[16-17]。IL-6由184个氨基酸构成,由成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞生成并分泌至细胞外,进而遏制Tyr磷酸化,降低PIP3激酶活力,激活NF-κB通路,加剧炎症反应[18]。IL-1β通过影响MCP-1等趋化因子,促进基质金属蛋白酶基因表达,从而发挥促炎效应[19]。目前西医常用的药物如克罗米芬、达英-35等无法改善机体炎症状态,且有不良反应,影响其临床疗效[20]。

PCOS属于中医学“癥瘕”“不孕”范畴,中医认为其病因包括先天肾精不足、脾主运化失调、肝失疏泄等,目前临床上常见证型为脾虚痰湿证[21-22]。PCOS病机为脾主后天之本,脾脏运化功能虚弱,则食欲不振;饮食水谷入于脾胃,转化水谷精微不足,易致腹胀、便溏;脾虚则后天之精不能布散四肢,则四肢乏力;精微不能上承入脑,则神疲倦怠;脾虚不能转输水液,则痰湿内生,湿阻下焦,累及胞宫,使其膏脂增加,同时脾虚致胞宫水谷精微减少,故而难以受孕[23-24]。因此,治疗应以益气健脾、祛湿化痰为原则[25]。本研究所使用的祛湿化痰方由苍术、半夏、茯苓、丹参、皂角刺、黄芩、黄柏、陈皮、甘草等药物组成。方中苍术燥湿健脾,半夏降逆祛痰,茯苓健脾利湿,丹参活血调经,皂角刺行气消肿,黄芩燥湿安胎,黄柏清热燥湿,陈皮健脾燥湿化痰,甘草健脾益气。诸药合用,共奏健脾祛湿化痰、调经助孕之功效。本研究结果表明,观察组治疗后的中医症候积分低于对照组,提示祛湿化痰方联合针刺能有效改善PCOS症状。

针刺治疗PCOS能发挥调月经、促排卵的作用[26]。本研究取穴以子宫、归来、中极、关元、足三里、三阴交为主穴,以血海、脾俞、丰隆为配穴。其中子宫清热利湿温肾,归来益气调经,中极滋肾调经,关元补气利尿,足三里健脾化痰,三阴交益气健脾补肾,血海调经统血,脾俞健脾化湿,丰隆化痰开窍。现代研究发现,针刺可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,减少卵泡闭锁,促进卵泡发育成熟[27]。针刺可减少血清IL-6和内脂素含量,恢复受高雄激素影响的卵巢形态及功能[28]。钟毅征等[29]发现,针刺能上调卵巢组织lncRNA MEG3表达,降低AKT水平,从而抑制炎症反应,恢复性激素水平及卵巢功能。本研究结果表明,观察组治疗后FSH、LH、T、卵巢体积低于对照组。上述结果提示,祛湿化痰方联合针刺能有效改善性激素水平,恢复子宫及卵巢生理功能。

PCOS相关的炎症反应由多种细胞因子参与调节,包括IL-1、IL-6和TNF-α。IL-1β是一种由Th2细胞产生的炎性细胞因子,在促进组胺生成和引发迟发型变态反应方面起到重要作用。IL-6由单核细胞和内皮细胞产生,反映了PCOS的严重程度。TNF-α是一种小分子蛋白质,由巨噬细胞分泌,在特异性免疫应答和炎症反应中起关键作用。研究发现,治疗后患者IL-1β、IL-6和TNF-α水平有所下降,而治疗组的下降幅度明显高于对照组。提示祛湿化痰方联合针刺可能通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平抑制炎症反应。

miRNA是一种长度22 nt的小分子核酸,具有影响基因表达转录、调节多种生理过程的作用[30]。miR-223在机体的血液、肝脏、肠道等多种组织器官中均有表达,其基因来源于X染色体,长度为22 nt,位于茎环结构的3’处,启动区域在多个物种间具有高度保守性[31]。韩超等[32]发现,脓毒症患者外周血miR-223水平升高,且miR-223水平与血清PCT、CRP水平呈正相关,miR-223能较好诊断早期脓毒症,评估炎症反应程度。郭云波等[33]研究表明,老年重症肺炎患者血清miR-223表达上升,与TNF-α水平呈正相关。miR-181a属于保守的miRNA家族,其可通过3’非编码区与特定基因序列结合,调节多种细胞功能[34]。研究表明,miR-181a通过抑制PIAS1,降低IL-6、TNF-α等细胞因子水平,从而阻断胰腺腺泡细胞凋亡,改善胰腺炎症状[35]。张瑜等[36]发现,急性胰腺炎患者血清miR-181a低表达,轻、中、重症三组患者miR-181a水平逐渐降低,且水平与IL-6呈负相关。本研究结果表明,miR-223与IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相关,miR-181a与IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相关,观察组治疗后的miR-223水平低于对照组,miR-181a水平高于对照组,提示祛湿化痰方联合针刺可能是通过降低miR-223水平、升高miR-181a水平,从而抑制下游炎症反应。

综上所述,祛湿化痰方联合针刺能调节PCOS患者性激素水平,恢复子宫内膜及卵巢功能,提高中医症候积分,抑制炎症反应,降低血清miR-223水平,升高miR-181a水平,miR-223、miR-181a均是PCOS治疗后1年内未妊娠的独立影响因素,二者对治疗后未妊娠有较好的预测价值。