circ_0008039调控乳腺癌细胞自噬、增殖及细胞周期机制研究

李 今,雷 莹,郭静姝,高建华

1.西北妇女儿童医院乳腺甲状腺外科,陕西西安 710061;2.榆林市第一医院普通外科二病区,陕西榆林 719000

乳腺癌的发病机制尚未完全明确,有研究发现乳腺癌中环状核糖核酸(circRNA)的表达失调可导致调控细胞发生增殖、迁移、侵袭等生物学行为,故circRNA可作为诊断乳腺癌的生物标志物[1-2]。有研究发现circ_001783通过充当微小RNA(miR)-200c-3p的海绵分子而参与乳腺癌的进展过程[3]。circ_0052112通过充当miR-125a-5p的海绵分子促进乳腺癌细胞迁移和侵袭[4]。circ_0008039在乳腺癌细胞中的表达水平升高,具有提高增殖、迁移能力的作用,与靶向miR-432-5p/E2F转录因子3(E2F3)轴相关[5]。miR-1287-5p在宫颈癌中呈低表达,circSLC26A4通过调节miR-1287-5p/同源盒蛋白Hox-A7(HOXA7)轴促进宫颈癌的进展[6]。靶基因预测显示circ_0008039与miR-1287-5p存在结合位点。目前在circ_0008039是否通过调节miR-1287-5p影响乳腺癌进展过程方面尚无相关研究。本研究旨在探讨circ_0008039对乳腺癌细胞自噬、增殖、细胞周期的影响及其机制。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年10月西北妇女儿童医院诊治的30例乳腺癌患者作为研究对象,年龄50～67岁,平均(60.03±4.68)岁,收集所有研究对象的乳腺癌组织和癌旁组织用于后续检测。纳入标准:(1)经症状体征、临床表现、影像学检查、术前或术后病理组织学检查确诊为乳腺癌;(2)首次确诊及治疗,既往无乳腺病史(包括乳腺癌、乳腺纤维瘤、乳腺炎等乳腺疾病);(3)未采取手术、化疗、放疗及内分泌等治疗手段;(4)卡氏功能状态(KPS)评分≥70分,预计生存期≥6个月。排除标准:(1)合并其他肿瘤、严重心血管病等疾病;(2)存在其他肿瘤乳腺转移。所有患者均知情同意且签署知情同意书。本研究经西北妇女儿童医院医学伦理委员会批准(YLL035)。

1.2方法

1.2.1实验分组 将健康人乳腺上皮细胞(MCF-10A)、乳腺癌细胞系(SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20)细胞置于DMEM培养液中培养,待融合度达70%时开始传代。调整数期BT-20细胞的密度为1×105/mL,并将其接种于96孔板,每孔100 μL,分别将si-NC、si-circ_0008039(敲低circ_0008039)、si-circ_0008039与anti-miR-NC、si-circ_0008039与anti-miR-1287-5p(下调miR-1287-5p)转染至BT-20细胞,分别记为si-NC组、si-circ_0008039组、si-circ_0008039+anti-miR-NC组及si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p组。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定circ_0008039、miR-1287-5p表达水平 提取癌旁组织、乳腺癌组织中MCF-10A、SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20细胞及转染后的BT-20细胞中的总RNA,测定水平后,采用反转录试剂获得cDNA,并以此为模板进行qRT-PCR,应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测circ_0008039、miR-1287-5p表达水平。

1.2.3CCK-8法检测BT-20细胞增殖 BT-20细胞经1.2.1处理后,用10 μL CCK-8溶液孵育细胞2 h,然后在450 nm处测量吸光度(A)。

1.2.4细胞周期检测 各组细胞加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、离心、重悬(500 μL),加入3.5 mL 预冷70%乙醇溶液,置于4 ℃环境中孵育24 h,以3 000 r/min离心5 min,去上清液,加入50 μL核糖核酸酶A(RNaseA),置于37 ℃环境中孵育30 min,加入450 μL碘化丙啶(PI)染色液,置于4 ℃环境中孵育30 min,采用上流式细胞仪测定细胞周期[包括细胞停止分裂(G0)期/DNA合成前(G1)期、DNA合成(S)期、DNA合成后(G2)期/细胞分裂(M)期]。

1.2.5双荧光素酶报告基因验证circ_0008039与miR-1287-5p的靶向关系 采用Circinteractome数据库预测显示circ_0008039与miR-1287-5的结合位点。BT-20细胞与构建成功的野生型/突变型载体WT/MUT-circ_0008039与miR-NC或miR-1287-5p mimics共转染。转染24 h后,检测荧光素酶活性。

1.2.6蛋白质印迹法(Western blotting)检测微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、Beclin-1、p21、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白的表达水平 用400 μL RIPA裂解液提取总蛋白,定量后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶分离蛋白,然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脱脂奶粉中封闭2 h,加入LC3B、Beclin-1、p21、CyclinD1一抗(1∶1 000),置于4 ℃环境中过夜;与二抗(1∶2 000)在室温下孵育1 h,采用增强型化学发光试剂(ECL)显影,计算LC3B、Beclin-1、p21、CyclinD1蛋白的表达水平。

1.3细胞与试剂 MCF-10A、SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20细胞购自美国ATCC细胞库;Lipofectamine2000购自北京索莱宝;si-NC、miR-NC、anti-miR-NC、si-circ_0008039、miR-1287-5p mimics、anti-miR-1287-5p购自上海吉玛;反转录试剂、荧光定量PCR试剂购自日本TaKaRa公司;Trizol试剂购自上海杰美基因医药科技有限公司;CCK-8试剂购自MCE公司;兔抗人LC3B、Beclin-1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人p21、CyclinD1抗体、山羊抗兔IgG(HRP标记)二抗购自美国Abcam公司。

2 结 果

2.1人乳腺癌组织和癌旁组织细胞中circ_0008039和miR-1287-5p的表达水平比较 乳腺癌组织的circ_0008039表达水平高于癌旁组织,miR-1287-5p表达水平低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 circ_0008039和miR-1287-5p在人乳腺癌组织和癌旁组织中的表达水平比较

2.25种乳腺细胞中circ_0008039的表达水平比较 乳腺癌SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20细胞中circ_0008039的表达水平高于MCF-10A细胞,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 circ_0008039在人乳腺癌细胞中的表达水平

2.3敲低circ_0008039后si-NC组和circ_0008039组的BT-20细胞A及相关蛋白水平比较 si-circ_0008039组A、CyclinD1蛋白表达水平低于si-NC组,LC3B、Beclin-1、p21蛋白表达水平高于si-NC组,差异均有统计学意义(P<0.05),见图1、表3。

图1 si-NC组和si-circ_0008039组自噬、增殖相关蛋白表达水平

表3 敲低circ_0008039后si-NC组和circ_0008039组的BT-20细胞A及相关蛋白水平比较

2.4敲低circ_0008039后si-NC组和circ_0008039组的BT-20细胞周期比例比较 si-circ_0008039组G0/G1期细胞比值大于si-NC组(P<0.05),两组S期细胞比例和G2/M期细胞比值比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 敲低circ_0008039后 si-NC组和circ_0008039组的BT-20细胞周期比例比较

2.5miR-NC组和miR-1287-5p组双荧光素酶活性比较 circ_0008039与miR-1287-5p存在互补的核苷酸位点,见图2。miR-1287-5p组WT-circ_0008039载体的荧光素酶活性低于miR-NC组(P<0.05), miR-NC组和miR-1287-5p组MUT-circ_0008039载体的荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

图2 circ_0008039与miR-1287-5p的结合位点

表5 miR-NC组和miR-1287-5p组双荧光素酶活性比较

2.6下调miR-1287-5p表达水平后si-circ_0008039+anti-miR-NC组及si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p组miR-1287-5p水平、A、BT-20细胞周期比例、相关蛋白水平比较 si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p组的miR-1287-5p水平、G0/G1期细胞比值、LC3B、Beclin-1、p21蛋白水平低于si-circ_0008039+anti-miR-NC组,si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p组的A、S期细胞比例、CyclinD1蛋白水平高于si-circ_0008039+anti-miR-NC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、表6。

图3 自噬、增殖相关蛋白表达水平

表6 下调miR-1287-5p表达水平si-circ_0008039+anti-miR-NC组及si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p组miR-1287-5p水平、A、BT-20细胞周期比例、相关蛋白水平比较

3 讨 论

circRNA在乳腺癌中的表达水平异常,同时可充当微小核糖核酸(miRNA)的海绵分子参与乳腺癌发病机制,circRNA_0006528作为竞争性内源RNA通过充当miR-7-5p的海绵分子并激活MAPK /ERK信号通路而促进乳腺癌的发展[7]。circRNA_0025202通过调节miR-182-5p /FOXO3a轴而调节乳腺癌的进展[8]。circEPSTI1可能作为判断乳腺癌患者预后的标志物[9]。目前circRNA对乳腺癌进展的影响及作用机制尚未完全明确。circ_0008039通过充当miR-515-5p的海绵分子而上调多梳蛋白4从而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。circ_0008039在膀胱癌组织中显著上调,其可能促进膀胱癌进展[11]。本研究结果显示,circ_0008039在人乳腺癌组织中表达水平升高,提示circ_0008039可能促进乳腺癌进展。进一步研究发现,敲低circ_0008039可抑制乳腺癌细胞活力,下调S期细胞比例,提高G0/G1期细胞比值,并可降低CyclinD1蛋白水平及提高p21蛋白水平。CyclinD1与p21蛋白在肿瘤中表达异常,并可通过调控细胞周期从而调节细胞增殖[12]。上述结果表明敲低circ_0008039对乳腺癌细胞增殖的抑制作用与阻滞细胞周期相关。细胞自噬水平升高可促进细胞凋亡,其中LC3B、Beclin-1蛋白水平升高预示自噬水平升高[13]。本研究结果显示,敲低circ_0008039可提高LC3B、Beclin-1蛋白的表达水平,提示敲低circ_0008039可促进乳腺癌细胞自噬。

本研究证实circ_0008039可充当miR-1287-5p的海绵分子,进一步研究发现miR-1287-5p在乳腺癌组织中表达水平降低,提示miR-1287-5p可能起抗乳腺癌的功能。miR-1287-5p通过与磷酸肌醇3激酶CB相互作用抑制乳腺癌的生长[14]。LncRNA PRKCQ-AS1通过调节miR-1287-5p/YBX1轴促进结直肠癌细胞增殖和迁移[15]。上调circ-UBE2D2可充当miR-1236/miR-1287的海绵分子,促进乳腺癌细胞转移和增殖[16]。本研究发现,下调miR-1287-5p表达水平可能提高乳腺癌细胞增殖能力,并降低自噬。本研究还发现,同时下调circ_0008039、miR-1287-5p表达可显著提高乳腺癌细胞活力,降低LC3B、Beclin-1蛋白的表达水平及G0/G1期细胞比值,并可提高S期细胞比例,提示抑制miR-1287-5p表达可明显逆转敲低circ_0008039对乳腺癌细胞自噬、增殖及细胞周期的作用。

综上所述,敲低circ_0008039可阻滞细胞周期、促进细胞自噬并抑制细胞增殖,其机制与上调miR-1287-5p表达有关,circ_0008039可能是乳腺癌治疗的潜在生物标志物,为研究circ_0008039在其他癌症中的作用提供了参考,也为乳腺癌的靶向分子治疗提供了新的理论基础。