斑蝥酸钠对食管癌EC9706细胞增殖、迁移及侵袭的影响及机制

谷 宁，王鹏辉，王振祥，崔凤琴，李志刚

(1.河南中医药大学第三附属医院肿瘤科一病区,河南 郑州 450000;2.河南中医药大学研究生院,河南 郑州 450000)

食管癌是临床常见的消化道肿瘤,其发病早期症状不明显,仅表现为吞咽食物哽噎感等进行性咽下困难,常被忽视,导致部分患者确诊时已进展为中晚期,甚至出现肝、脑等组织器官转移[1-2]。我国食管癌的发病率约为20.35/10万,病死率约为15.17/10万,其病死率位居所有恶性肿瘤第4位[3-4]。目前,由于临床中食管癌的治疗方法及药物种类有限,食管癌患者的5 a总生存率低于40%[5-6];因此,仍需对食管癌治疗药物进行研究开发。斑蝥酸钠是从中药材斑蝥中提取分离得到的单体化合物,其对肝癌等多种肿瘤具有显著的治疗作用[7]。近年来研究发现,斑蝥酸钠在食管癌的治疗中亦具有显著疗效;邓亚男[8]研究报道,斑蝥酸钠联合常规化学治疗能够显著降低食管癌患者肿瘤标志物水平及炎症因子水平;梁枫等[9]研究报道,斑蝥酸钠能够显著抑制食管癌EC9706细胞的增殖,促进EC9706细胞的凋亡,并抑制抗凋亡基因在EC9706细胞中的表达。但是,目前斑蝥酸钠对食管癌的治疗作用和机制尚不完全清楚。Wnt3a/β-catenin通路参与多种肿瘤疾病的发生及进展。近年来研究发现,抑制Wnt3a/β-catenin通路蛋白能够显著促进食管癌TE-1细胞凋亡[10];大蒜素能够显著抑制食管癌模型大鼠肿瘤体积、瘤重及瘤体数量,其机制可能与抑制Wnt3a及β-catenin通路有关[11]。由此可见,调节Wnt3a/β-catenin通路蛋白水平可能是治疗食管癌的有效途径。基于此,本研究观察斑蝥酸钠对于食管癌EC9706细胞的增殖、迁移、侵袭及Wnt3a/β-catenin通路蛋白表达的影响,探讨斑蝥酸钠对食管癌的治疗作用和机制,为斑蝥酸钠的药理作用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器

人源食管癌EC9706细胞购自中国科学院上海细胞库。斑蝥酸钠购自上海信裕生物科技有限公司(纯度>98%),顺铂购自上海吉至生化科技有限公司(纯度>99%),达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司,Wnt3a、β-catenin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自上海碧云天生物技术有限公司,RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司,结晶紫购自上海宝曼生物科技有限公司,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物设计及合成由赛默飞世尔科技(中国)有限公司完成;BXT-TGL16M台式高速冷冻离心机购自德国BAXIT公司,MK3酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,Mastercycler X50h PCR仪购自德国Eppendorf公司,IX83荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司,COP-T细胞培养箱购自上海笃特科学仪器有限公司,Gel Doc EZ凝胶成像仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将EC9706细胞接种于含体积分数10% 胎牛血清和青霉素(100 000 U·L-1)-链霉素(100 mg·L-1)混合液的DMEM,置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养,待细胞生长至融合度为80%时,去除培养液,加入PBS洗涤2次后,使用胰蛋白酶消化并收集细胞,进行后续实验。

1.2.2 细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测EC9706细胞增殖率

将EC9706细胞密度调整为2×107L-1,按每孔100 μL将EC9706细胞混悬液接种于96孔板中,置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,将细胞随机分为空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组细胞中分别加入终质量浓度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸钠继续培养,顺铂组细胞中加入终质量浓度140 mg·L-1的顺铂继续培养,空白对照组加入等量新鲜DMEM继续培养;分别于培养24、48、72 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,于细胞培养箱中继续孵育1 h后,使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度(absorbance,A)值,计算各组细胞增殖率,细胞增殖率=A实验组/A空白对照组×100%。每组设置3个复孔,取均值。

1.2.3 划痕实验检测EC9706细胞迁移率

用记号笔在6孔板后均匀画横线,将EC9706细胞按每孔5×105个细胞接种于6孔细胞培养板中,加入不含胎牛血清及青-链霉素的DMEM,置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,将细胞随机分为空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组细胞中分别加入终质量浓度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸钠继续培养,顺铂组细胞中加入终质量浓度140 mg·L-1的顺铂继续培养,空白对照组加入等量新鲜DMEM继续培养;继续培养48 h后,使用移液枪枪头在培养板底细胞作一划痕,测量划痕距离(记为D1);继续培养24 h后,于显微镜下再次测量划痕距离(记为D2);计算细胞迁移率,细胞迁移率=(D1-D2)/D1×100%。每组设置3个复孔,取均值。

1.2.4 Transwell实验检测EC9706细胞侵袭率

取EC9706细胞,调整细胞密度为1×108L-1,将细胞接种至6孔细胞培养板中,加入不含胎牛血清及青-链霉素的DMEM,置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,将细胞随机分为空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组细胞中分别加入终质量浓度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸钠,顺铂组细胞中加入终质量浓度140 mg·L-1的顺铂,空白对照组加入等量新鲜DMEM并继续培养;继续培养48 h后,收集各组细胞,调整细胞密度为2×107L-1,于Transwell下室加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM,取 100 μL 细胞加入Transwell小室,于细胞培养箱中继续培养24 h;然后,用棉签擦去上表面的细胞,使用结晶紫染色后,对细胞进行计数,计算细胞侵袭率。细胞侵袭率=实验组细胞数/空白对照组细胞数×100%,空白对照组细胞侵袭率记为100%。实验重复3次,取均值。

1.2.5 实时定量PCR法检测EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA水平

取EC9706细胞,调整细胞密度为1×108L-1,将细胞接种至6孔细胞培养板中,加入不含胎牛血清及青-链霉素的DMEM,置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,将细胞随机分为空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组细胞中分别加入终质量浓度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸钠,顺铂组细胞中加入终质量浓度 140 mg·L-1的顺铂,空白对照组加入等量新鲜DMEM并继续培养;培养48 h后,收集细胞,使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,使用PCR试剂盒对Wnt3a及β-catenin mRNA 水平进行定量分析。引物序列:Wnt3a正向引物为5′-GCACCTGAATAGGCAAGTC-3′,反向引物为5′-TCGCACCACCTCAATAAGT-3′;β-catenin正向引物为5′-GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3′,反向引物为5′- GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3′;GAPDH正向引物为5′-AAAGTGTGGGCTGAAGCAGT-3′,反向引物为5′-CAGCATAGTGGATGGCCTTT-3′。PCR反应体系:定量PCR试剂10 μL,引物各1 μL,cDNA模板2 μL,无RNA酶水6 μL。反应条件:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,共40个循环。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算Wnt3a及β-catenin mRNA相对表达量。实验重复3次,取均值。

1.2.6 Western blot法检测EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相对表达量

取EC9706细胞,调整细胞密度为1×108L-1,将细胞接种至6孔细胞培养板中,加入不含胎牛血清及青-链霉素的DMEM,置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h后,将细胞随机分为空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组细胞中分别加入终质量浓度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸钠,顺铂组细胞中加入终质量浓度为140 mg·L-1的顺铂,空白对照组加入等量新鲜DMEM并继续培养;培养48 h后收集各组细胞,加入细胞裂解缓冲液,充分裂解后,4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min,取上清液,采用BCA蛋白质测定法定量总蛋白;取相当于40 μg蛋白的细胞裂解液进样至聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,并将其电转移到聚偏氟乙烯膜上,使用牛血清白蛋白在室温下封闭1 h,分别滴加Wnt3a、β-catenin及GAPDH兔单克隆抗体(滴度均为11 000),4 ℃孵育过夜;然后,使用含吐温-20的PBS清洗3次,每次5 min,使用辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG(滴度为12 000)室温孵育2 h,再次使用含吐温-20的PBS清洗3次;取出聚偏氟乙烯膜,滴加超敏增强型化学发光液,应用凝胶成像系统拍照成像;使用ImageJ 1.4.0软件分析条带,以GAPDH为内参,目的蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示。实验重复3次,取均值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 5组EC9706细胞增殖率比较

培养24、48、72 h,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞增殖率显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞增殖率显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞增殖率显著高于中剂量斑蝥酸钠组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞增殖率随着培养时间的延长显著降低(P<0.05)。结果见表1。

2.2 5组EC9706细胞迁移率比较

空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞迁移率分别为(83.65±3.49)%、(66.93±3.90)%、(40.68±2.43)%、(19.34±4.44)%、(16.87±4.21)%。低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞迁移率显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞迁移率显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞迁移率显著高于中剂量斑蝥酸钠组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图1。

A:空白对照组;B:低剂量斑蝥酸钠组;C:中剂量斑蝥酸钠组;D:高剂量斑蝥酸钠组;E:顺铂组。

2.3 5组EC9706细胞侵袭率比较

空白对照组、低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞侵袭率分别为(100.00±0.00)%、(71.09±3.13)%、(52.20±4.50)%、(35.13±5.96)%、(34.88±3.11)%。低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞侵袭率显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞侵袭率显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞侵袭率显著高于中剂量斑蝥酸钠组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞侵袭率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图2。

A:空白对照组;B:低剂量斑蝥酸钠组;C:中剂量斑蝥酸钠组;D:高剂量斑蝥酸钠组;E:顺铂组。

2.4 5组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA 相对表达量比较

低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相对表达量显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相对表达量显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相对表达量显著高于中剂量斑蝥酸钠组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

2.5 5组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相对表达量比较

低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin 蛋白相对表达量显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相对表达量显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin 蛋白相对表达量显著高于中剂量斑蝥酸钠组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin 蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图3和表3。

表2 5组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相对表达量比较Tab.2 Comparison of relative expression levels of Wnt3a and β-catenin mRNA in EC9706 cells among the five groups

A:空白对照组;B:低剂量斑蝥酸钠组;C:中剂量斑蝥酸钠组;

表3 5组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相对表达量比较Tab.3 Comparison of relative expression levels of Wnt3a and β-catenin protein in EC9706 cells among the five groups

3 讨论

食管癌是临床中常见的消化道肿瘤,我国食管癌患者约占全球食管癌患者的80%以上[12]。食管癌的发生与亚硝胺类物质摄入、饮食习惯及生物性因素等密切相关。食管癌在早期临床表现为吞咽困难等症状,症状不明显,病情进展缓慢,因此,患者确诊时可能已进展为中晚期。目前,对于食管癌的主要治疗方式有手术治疗、放射治疗及化学治疗。然而,仍有部分经上述治疗手段治疗的患者预后差,且存在易复发、患者生活质量降低等缺点;另外,放射治疗及化学治疗后易导致患者出现骨髓抑制、放射性食管炎等多种不良反应[13]。顺铂是目前临床中常用的治疗食管癌的药物,通过破坏癌细胞DNA复制发挥抗癌体用[14],但在临床应用中,顺铂及其联合其他化学治疗药物的治疗方案均表现出有效率低且不良反应发生率高的特点。有研究表明,采用顺铂联合吉西他滨化学治疗的食管癌患者有效率约为66%,治疗后2 a患者生存率低于40%[15]。因此,食管癌治疗药物的研发仍是当前工作重点。

斑蝥酸钠是从传统中药材斑蝥中提取分离并进一步加工合成后得到的化合物,现代医学研究发现其具有抗肿瘤、免疫调节等多种作用[16-17],其对于肺癌、乳腺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤疾病均具有显著的药理作用[18-20]。近年来研究发现,斑蝥酸钠对于食管癌也具有显著的治疗作用。刘德仁等[21]临床研究表明,斑蝥酸钠能够显著改善晚期食管癌患者恶心呕吐、四肢无力等症状,且与常规化学治疗方案比较,斑蝥酸钠能够明显提高患者肿瘤缓解率;蒋淑年等[22]研究发现,斑蝥酸钠能够显著提高患者放射治疗的有效率,且不增加毒副作用;贾金明等[23]研究发现,斑蝥酸钠能够提高晚期食管癌患者静脉化学治疗的效果,并减少不良反应的发生,提高患者生存质量。由此可见,斑蝥酸钠对于食管癌的治疗具有较大潜力。然而,目前斑蝥酸钠对于食管癌的作用机制尚不明了。本研究结果显示,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞的增殖率、迁移率及侵袭率显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞的增殖率、迁移率及侵袭率显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞的增殖率、迁移率及侵袭率显著高于中剂量斑蝥酸钠组;而高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞的增殖率、迁移率及侵袭率比较差异无统计学意义。这提示,斑蝥酸钠能够显著抑制食管癌细胞的增殖能力,并能够通过抑制其侵袭和迁移能力抑制其在体内的转移,且呈一定的剂量依赖性;高剂量斑蝥酸钠对EC9706细胞增殖能力及侵袭、迁移能力等方面的影响与顺铂相似效果。

Wnt3a及β-catenin通路是近年来发现的与肿瘤发生发展相关的重要信号通路。彭慧等[24]研究发现,Wnt3a及β-catenin通路异常激活与食管癌TE1、Eca109及EC9706细胞的增殖和迁移有关,而抑制Wnt3a及β-catenin通路相关蛋白水平能够显著抑制TE1、Eca109及EC9706细胞增殖和迁移能力;王璋等[25]研究发现,通过白藜芦醇抑制Wnt3a及β-catenin蛋白水平能够显著抑制KYSE150、TE-1及Eca-109细胞的增殖,降低细胞存活率。由此推测,Wnt3a/β-catenin通路可能是食管癌发生及进展过程中的重要通路,抑制Wnt3a及β-catenin蛋白的表达可能是抑制食管癌进展的重要手段,其可能是食管癌治疗中的重要潜在靶点。本研究结果显示,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组、高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相对表达量显著低于空白对照组,低剂量斑蝥酸钠组、中剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相对表达量显著高于高剂量斑蝥酸钠组和顺铂组,低剂量斑蝥酸钠组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相对表达量显著高于中剂量斑蝥酸钠组,高剂量斑蝥酸钠组与顺铂组EC9706细胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义;说明,斑蝥酸钠能够呈剂量依赖性地显著抑制食管癌EC9706细胞中Wnt3a、β-catenin的表达,进而抑制Wnt3a、β-catenin的异常激活,导致Wnt3a/β-catenin通路障碍,从而抑制EC9706细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

4 结论

斑蝥酸钠能够抑制食管癌EC9706细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与调节Wnt3a/β-catenin通路有关。但是,本研究未探讨斑蝥酸钠对EC9706细胞Wnt3a/β-catenin通路上下游其他相关蛋白表达的影响,有待进一步研究。