新疆维吾尔自治区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒16型E4和L2的遗传变异分析

程豪政,妥 静,董杨柳,王 乐,者湘漪,李洪涛,李冬妹,潘泽民

宫颈癌(cervical cancer,CC)是妇女恶性肿瘤死亡的第四大因素[1]。据报道[2],中国新疆维吾尔自治区宫颈癌发病率与病死率很高,该地区人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus, HPV)阳性率为14.02%,其中多为HPV52、HPV53、HPV16和HPV18。

研究[3]表明,感染HPV16具有更强的致病性和致癌性。HPV16分为A谱系、B谱系、C谱系和D谱系4种变异谱系[4],中国新疆维吾尔自治区女性感染HPV16以欧洲病毒株为主[5]。HPV16 E4基因产物E4蛋白质,是HPV表达量最高的蛋白质,其氨基酸主要来源于E4开放阅读框(open reading frame, ORF),且E4 ORF包含在E2 ORF内[6-7]。E4蛋白质可增强病毒复制和病毒粒子的排出[8-10]。HPV衣壳蛋白质在病毒进入细胞与细胞核的过程中起关键作用[11-12]。L2促进了病毒基因组的逆行运输,促进细胞间期将病毒基因组整合到宿主基因[13-14]。新疆维吾尔自治区HPV16 E4和L2基因的变异及分布特征尚不清楚,因此,研究HPV16 E4 和L2基因变异,有助于发现HPV16基因变异位点与宫颈癌的发生和发展的关系。

1 材料与方法

1.1 样本的采集在伊犁州友谊医院、喀什地区人民医院和石河子大学附属医院共收集了80例患者的HPV16感染阳性的宫颈细胞样本(脱落细胞40例,组织细胞40例);样本收集取得了所有患者的知情同意。所有患者都无外地的长期旅居史,收集样本存放于-80 ℃低温冰箱。

1.2 样本的DNA提取与PCR扩增DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)提取DNA,DNA储存在 -20 ℃的冰箱。混合反应液(40 μl)包括2×Taq PCR SuperMix 20 μl,引物各1 μl及2 μl样本DNA。反应程序温度控制为94 ℃,持续5 min;34个循环×(94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min);72 ℃ 5 min。存放于-20 ℃冰箱。引物的信息,见表1。

表1 引物信息

1.3 测序上海天昊遗传分析中心对40例脱落细胞DNA样品进行基因测序检测,用虾碱性磷酸酶(北京生物技术有限公司)和核酸外切酶I(北京生物科技有限公司)纯化PCR产物。使用Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(美国ABI公司),酒精纯化产物后,DNA分析仪(ABI3130XL)测样品基因序列。40例组织细胞DNA样本通过Illumina Hiseq平台,以2×150 bp双端测序模式进行高通量测序,获得FastQ数据。

1.4 HPV16变异株进化分析分析单核苷酸多态性(Polyphred软件),与欧洲原型病毒株(GenBank:NC_001526.4)的序列比对,同时与其他HPV16变异病毒株比对:欧洲株A1-A3:A1(HQ644283.1,HQ644268.1,HQ644280.1,HQ644282.1),A2:(AF536179.1),A3:(HQ644236.1);亚洲株A4[HQ644235.1(A4),HQ644248.1,AF534061.1,HQ644251.1];非洲株AF:B(HQ644238.1,HQ644240.1,HQ644290.1,HQ644298.1);C(AF472509.1,HQ644239.1,HQ644249.1,HQ 644237.1);北美NA:D1(HQ644257.1);亚美型AA:D2(HQ644263.1, HQ644277.1,HQ644279.1,HQ644281.1);D3(HQ644247.1,HQ644255.1,HQ644253.1,AF 402678.1)。MEGA11构建系统发育树。

1.5 统计学处理直接计数HPV16 E4、L2基因变异位点的变异频数,SPSS 26.0软件分析统计结果,使用χ2检验的统计方法,分析HPV16 E4、L2单核苷酸变异与宫颈癌的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV16 E4、L2基因的变异分析HPV16 E4和L2基因变异结果:80例DNA样本基因测序结果,其多态性位点见表2、3。

表2 HPV16 E4 基因变异与氨基酸的改变

在80例HPV16阳性样本中,72例样本存在HPV16 E4基因变异,10个位点存在核苷酸变异,包括4种错义变异和7种同义变异,其中错义变异分别为:A2541C(1/72,1.39%)、G2621C(1/72,1.39%)、A2636C(3/72,4.17%)和T2703G(1/72,1.39%)。氨基酸改变分别为:苏氨酸替换为脯氨酸(T25P)、谷氨酰胺替换为组氨酸(Q51H)、谷氨酸替换为天冬氨酸(E56D)、亮氨酸替换为缬氨酸(L79V)。常见同义变异为nt2520(T-C)(28/72,38.89%)、nt2546(C-T/A)(70/72,97.22%;1/72,1.39%)、nt2585(G-A)(25/72,34.72%)、nt2660(T-C)(28/72,38.89%)。

在80例HPV16阳性样本中,74例样本存在HPV16 L2变异,40个位点存在核苷酸变异,包括23种错义变异和18种同义变异。如表3所显示,HPV16 L2最常见的错义变异核苷酸变异位点为:T4177C、A4362C、A4362T和A4654C,其氨基酸变化为丝氨酸转变为脯氨酸(S269P)、亮氨酸转变为苯丙氨酸(L330F)和异亮氨酸转变为亮氨酸(I428L)。17种同义变异中变异频率较高的位点为:nt4074(G-A)(73/74,98.65%)和nt4602(A-G)(15/74,20.27%),G4074A普遍存在于变异样本中。

表3 HPV16 L2基因变异和氨基酸改变

表4 病例组与对照组中HPV16 E4的基因变异

表5 病例组与对照组中 HPV16 L2 基因组的基因变化

2.2 HPV16 E4和L2核苷酸序列系统进化树使用N-J法,Bootstrap method(1000 replication)和Kimura 2-parameter model构建HPV16 E4、L2基因系统进化树,只显示大于50%的Bootstrap值,其中Bootstrap值>70%提示可靠性很好,系统发育树见图1。通过HPV16 E4、L2的系统进化树可以发现有76个样本为欧洲变体,4个样本为亚洲变体。没有发现非洲变体、美洲变体和亚美变体。亚洲变体X18、X20、Z91和CN-148中的变异都与 G4181A变异相关。

图1 HPV16病毒E4和L2基因进化分析及病毒株统计

2.3 病例组与对照组中HPV16 E4、L2的基因变异

2.3.1病例组和对照组中HPV16 E4基因组的基因变异 如表4所示,通过对病例组(宫颈癌组)与对照组(非宫颈癌组)中E4基因变异进行统计,发现对照组有1种错义变异,病例组有3种错义变异,统计结果显示,这些错义变异在对照组与病例组之间没有显著差异(P>0.05)。

2.3.2病例组与对照组基因组HPV16 L2的遗传变异 如表5显示的对照组和病例组中L2基因的错义变异分布。对照组有17种错义变异,病例组有14种错义变异,其中错义变异T4177C(P=0.012),A4288C(P=0.04)和A4654C(P=0.026)在病例组变异频率明显高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),氨基酸变化分别为丝氨酸转变为脯氨酸(S269P)、异亮氨酸转变为亮氨酸(I306L)和异亮氨酸转变为亮氨酸(I428L)。差异有统计学意义的错义变异位点测序结果,见图2。

图2 HPV16 L2基因错义变异具有显著差异位点的测序结果

3 讨论

HPV基因变异的研究大多聚焦在病毒E6和E7基因上,而E6和E7的变异会对宫颈癌的发生与发展产生影响。HPV16 E4基因变异和缺失会影响病毒粒子在细胞间的传播,L2基因的变异和缺失会导致病毒基因组整合到细胞核染色体过程的改变[8-13]。

通过HPV16 E4、L2的系统进化树显示,有76个样本为欧洲变异株,4个样本为亚洲变异株。这与已有报道[15]的新疆维吾尔自治区主要流行株为欧洲株,少数为亚洲株的情况类似,然而4例亚洲变异株均与L2基因错义变异G4181A有关,这一发现尚未有相关文献报道。在HPV16 E4上常见的错义变异位点发生频率并不高,且HPV16 E4基因位于E2基因的中心位置,该区域编码E2蛋白质的铰链结构域[6-7]。E4基因最常见的同义变异C2546T(97.22%)和G2585A(34.72%)在HPV16 E2基因的表达中为错义变异,且位于E2基因铰链区间接导致E2蛋白质的氨基酸改变,最终导致E6、E7表达的变化,表2显示的 E4基因变异G2504A、T2520C、C2546T、G2585A、T2660C和T2703G与已有的关于E4的报道结果一致[16],而错义变异A2541C、G2621C、A2636C和同义变异T2672G尚未见文献报道。

在HPV16 L2基因上常见的错义变异位点分别为T4177C、A4362C/T和A4654C,其氨基酸变化分别为S249P、L330F和I428L,且同义变异G4074A普遍存在于样本中。研究表明L2基因的错义变异T4177C、A4288C和A4654C在病例组中高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。L2蛋白质对病毒基因组进入细胞核有促进作用,可以表明该变异可能会促进病毒基因组的感染和整合,这仍需要深入研究给予证明。由于HPV16 E4和L2在病毒感染和传播方面的作用,E4基因的改变会间接影响E2基因的变化,最终导致E6和E7表达的改变,因此,可以通过E4基因的变异间接了解病毒的复制及传播能力。此外,还可以结合细胞实验研究HPV16 L2基因 T4177C、A4288C和A4654C的变异对病毒基因组侵入细胞与整合到细胞基因组的作用。

综上所述,新疆维吾尔自治区主要流行病毒株为欧洲株,少数为亚洲株;HPV16 L2基因中T4177C、A4288C、A4654C在宫颈癌中的变异频率高于非宫颈癌,且G4181A与亚洲株相关。