TAZ基因多态性与非贲门胃癌的关系

王巧巧,高 芳, 董文杰,阎小霞,陈雅茹,贾彦彬

胃癌(gastric cancer,GC)是一个全球性的健康问题,全球每年超过100万人被诊断为胃癌,其依然是癌症死亡的主要原因之一[1]。研究[2-7]表明,作为Hippo信号通路下游重要的效应分子,含PDZ结合基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)与肿瘤的发生发展以及预后密切相关。TAZ可作为多种癌症的生物标志物,同时也是胃癌防治的重要生物靶标之一。因此,TAZ基因是胃癌变研究过程中的一个重要候选基因。该实验选取了包头汉族人群作为研究对象,探讨TAZ基因多态性与非贲门胃癌发病风险的关系,进而为非贲门胃癌的早期诊断、预防和治疗提供实验支撑和理论依据,也为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料样本纳入标准及排除标准在文献[8]中已有报道:选取在包头地区生活5年以上的互无血缘关系的汉族人群,且3代以内无与其他民族通婚史,其中病例组为2008—2020年期间在包头市肿瘤医院以病理学确诊的非贲门胃癌病例460例,其中343例为男性,117例为女性,年龄为26～83(60.37±10.42)岁,并排除了继发与复发型胃癌、接受过化疗和放疗的病例。正常对照为同期在包头医学院第一附属医院和内蒙古包钢医院正常体检者470例,其中男性324例,女性146例,年龄为33～93(59.08±10.71)岁,排除标准为有明显的胃部疾病史、胃部手术、癌症病史及遗传病史、幽门螺杆菌清除治疗史者。性别和年龄分布在正常对照组及非贲门胃癌病例组中差异无统计学意义(年龄:t=-1.859,P=0.063;性别:χ2=3.632,P=0.057)。所有研究对象均签署了知情同意书,该研究已得到包头医学院医学伦理委员会的批准,批准号:包医伦审人体2021第(006)号。

1.2 方法

1.2.1单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的选择 选择已有文献[9-10]报道与疾病进行过研究或位于TAZ基因编码区和调控区的SNPs,且其在中国汉族人群中最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>5%。该实验共筛选出rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239 4个SNP进行研究。

1.2.2基因分型 提取所有样本人全血基因组DNA,基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。用Primer 3在线软件设计各位点的引物并由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。25 μl PCR体系包含有:1 μl上游引物(5 μmol/L)、1 μl下游引物(5 μmol/L)、12.5 μl 2×Taq Master Mix、8.5 μl ddH2O、2 μl DNA模板(50 ng)。PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,最后72 ℃延伸5 min。引物序列及PCR长度见表1。各位点PCR产物经相应的限制性内切酶作用,10 μl酶切体系为:1 μl 10×NE Buffer、2 μl PCR产物、0.4 μl限制性内切酶、6.6 μl ddH2O。酶切产物通过2%的琼脂糖凝胶进行电泳,根据电泳结果显示的片段大小判断基因型,酶切片段及反应条件见表2。

表1 TAZ基因各SNP位点的PCR引物序列及扩增长度

表2 各SNP位点的酶切条件及酶切片段

2 结果

2.1 TAZ基因各SNP与非贲门胃癌发病风险的关系在对照组中,TAZ基因rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239 4个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(rs16861985:χ2=5.565,P=0.062;rs1055153:χ2=5.571,P=0.062;rs6783790:χ2=3.016,P=0.221;rs12490239:χ2=3.873,P=0.144)。

分析结果显示:rs16861985在所有样本中未出现GG基因型,其与非贲门胃癌的发病风险相关,与携带CC基因型者相比,携带GC基因型者非贲门胃癌的发病风险增加(OR=1.547,95%CI:1.145～2.089);rs1055153在共显性、显性、超显性模型下均与非贲门胃癌的发病风险相关,其中显性模型AIC(1 277.1)和BIC(1 296.4)的值最小,为最佳模型,与携带GG基因型者相比,携带GT+TT基因型者非贲门胃癌的发病风险降低(OR=0.570,95%CI:0.400～0.814); rs6783790、rs12490239与非贲门胃癌发病风险无关联。见表3。

表3 TAZ基因各SNP与非贲门胃癌发病风险的关系[n(%)]

2.2 TAZ基因单体型与非贲门胃癌发病风险的关系对TAZ基因SNP rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239进行单体型构建并分析各单体型与非贲门胃癌发病风险的关系,结果显示C-G-A-A、C-G-A-G、C-G-G-A、C-T-G-A、G-G-A-G 5种单体型中,C-G-A-A单体型降低了非贲门胃癌的发生风险(OR=0.761,95%CI:0.612～0.945);G-G-A-G单体型增加了非贲门胃癌的发生风险(OR=1.894, 95%CI:1.314～2.730);其他单体型与非贲门胃癌的发病风险无关联。结果见表4。

表4 单体型与非贲门胃癌发生风险的关系

2.3 SNP-SNP对非贲门胃癌发病风险的交互作用分析对TAZ基因多态性位点进行SNP-SNP交互作用分析,将性别和年龄纳入协变量。通过交叉验证一致性最大、检验准确率最高和差异有统计学意义筛选出最优的交互模型。结果显示,在非贲门胃癌发生风险中四阶模型(rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239)存在交互作用(P<0.05)。见表5。

表5 SNP-SNP对非贲门胃癌发病风险的交互作用分析

3 讨论

Hippo信号通路最早在果蝇的研究[11]中被发现,是一条进化上高度保守的激酶级联通路,在细胞增殖、分化、先天免疫和再生的调节中发挥关键作用。TAZ作为Hippo通路的转录辅激活子及下游的重要效应分子可与TEAD等转录因子相互作用,调节靶基因的表达,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。TAZ参与多种癌症发生发展过程,包括癌细胞生长、迁移和多种恶性肿瘤的远端转移[12-13]。

目前研究[14]表明,TAZ在胃肿瘤组织中的表达明显高于正常组织,TAZ的表达与不良预后显著相关,与胃腺癌术后生存率呈负相关;同时TAZ的表达还与胃腺癌的肿瘤侵袭和转移呈正相关。TAZ被认为是胃癌发生和不良预后的生物标志物。因此,TAZ基因是胃癌变分子遗传学研究的重要候选基因。该实验选择了TAZ基因的4个多态性位点rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239进行研究,结果显示SNP rs16861985、rs1055153与非贲门胃癌的发生风险相关,rs6783790、rs12490239与非贲门胃癌的发生风险无关联。

SNP rs16861985位于TAZ基因的内含子区,rs1055153位于TAZ基因的编码区,G突变为T导致脯氨酸到精氨酸的改变。Shen et al[9]研究表明rs16861985、rs1055153与中国肝癌患者的预后生存之间无关联。该实验结果显示,SNP rs16861985与非贲门胃癌的发病风险相关,与携带CC基因型者相比,携带GC基因型者非贲门胃癌的发病风险增加;而SNP rs1055153也与非贲门胃癌的发病风险相关,与携带GG基因型者相比,携带GT+TT基因型者非贲门胃癌的发病风险降低。因此,在包头地区汉族人群中与CC基因型相比,TAZ基因SNP rs16861985的GC基因型可能是非贲门胃癌发生的危险因素;与GG基因型相比,TAZ基因SNP rs1055153的GT+TT基因型可能是非贲门胃癌发生的保护因素。该实验与Shen et al[9]的研究结果不同,可能是由于SNP rs16861985、rs1055153在不同的消化道肿瘤中所起的作用有所不同。

SNP rs6783790位于TAZ基因的内含子区,有文献[10]报道SNP rs6783790与结肠癌的复发无关联。该实验结果显示其与非贲门胃癌发病风险无关联。该研究结果与Sebio et al[10]的研究结果提示SNP rs6783790可能在胃肠道肿瘤的发生发展中不起主要作用。

SNP rs12490239位于TAZ基因的5’UTR区,可能具有潜在的调控作用。该实验结果显示在共显性、显性、隐性、超显性4种遗传模型中TAZ基因SNP rs12490239均与非贲门胃癌发病风险无关联。提示TAZ基因SNP rs12490239可能在非贲门胃癌的发病风险中不起主要作用,需要继续扩大研究样本量,进一步明确SNP rs12490239与非贲门胃癌发生风险之间的关系。

采用SHEsis在线软件对TAZ基因SNP rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239进行单体型构建,结果显示,在C-G-A -A、C-G-A-G、C-G-G-A、C-T-G-A、G-G-A-G 五种单体型中,C-G-A-A单体型降低了非贲门胃癌的发生风险;G-G-A-G单体型增加了非贲门胃癌的发生风险;其他单体型与非贲门胃癌的发病风险无关联。关于这4个SNP的单体型与非贲门胃癌的关系还需进一步研究确证。

在该实验中,采用GMDR软件对TAZ基因多态性位点rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239进行SNP-SNP交互作用分析,统计结果显示在四阶模型中,这些SNP在非贲门胃癌发生风险中存在交互作用。提示这四个SNP的交互作用在非贲门胃癌发生风险中可能扮演了一定的角色。