靶向骨肉瘤PD-1/PD-L1信号通路探针的实验研究

黄海峰,邹 欢,王 炼,杨先腾,朱 华,李姗姗

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,研究[1]表明,合并肺部转移的骨肉瘤患者的1、2、5年生存率逐年下降(93.3% ～ 11.5%)。免疫治疗可能是骨肉瘤治疗的新希望,因此,阻断骨肉瘤患者的程序性死亡受体-1/程序性死亡受体配体-1(programmed death receptor-1 /programmed death receptor ligand-1,PD-1/PD-L1)信号通路可以作为治疗骨肉瘤患者的重要策略。PD-L1单抗特异性作用于肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白受体,从而阻碍T细胞上的PD-1受体与肿瘤细胞表面的PD-L1配体结合,进一步起到抑制T细胞免疫逃逸的功能。恶性肿瘤患者的PD-1/PD-L1的表达水平与免疫治疗的作用呈正相关,与预后呈负相关,因此,抗PD-L1单克隆抗体可以逆转PD-1/PD-L1免疫检查点对T细胞应答的阻断作用。用于治疗恶性肿瘤的PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已经被视为肿瘤学的一项革命性创新[2]。PD-L1是在恶性肿瘤细胞膜上高度表达的跨膜蛋白[3]。已经有研究[4]表明,PD-L1过表达预示恶性肿瘤愈后不佳,但接受PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗的恶性肿瘤患者生存期会更长。该研究报道了靶向PD-L1的124I-anti-PD-L1单克隆抗体分子探针的成功合成,并进一步通过微型正电子发射断层显像/计算机断层成像(micro positron emission tomography/ computed tomography, Micro-PET/CT)实时评估了OS-732骨肉瘤小鼠模型中的PD-L1受体蛋白表达的状态。

1 材料与方法

1.1 主要实验瘤株及实验动物OS-732皮下荷瘤鼠:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所。18～20 g BALB/c裸鼠,5～6周龄,SPF级(无特定病原体),雌性:北京维通利华实验动物技术有限公司。18～20 g KM小鼠, 5～6周龄,SPF级(无特定病原体),雌性: 北京华阜康生物科技股份有限公司

1.2 主要试剂同位素124I-I2和anti-PD-L1抗体由北京大学肿瘤医院核医学科提供; PD-L1抗体(TA809809S,美国Origene公司);二抗:山羊抗兔IgG/HRP聚合物(PV-6002,北京中杉金桥生物公司)。

1.3 方法

1.3.1Anti-PD-L1抗体毒性实验 PBS组(对照组)及anti-PD-L1组(给药组)各5只KM小鼠(随机分组),小鼠尾静脉分别注射50 μg anti-PD-L1或者同体积PBS,每周2次,连续4周。每周2次称取小鼠体质量,第8次给药后6 d,即31 d后处死小鼠,取肝、脑、肺、肾组织,行HE染色;组织学层面确定肝、脑、肺、肾有无损伤。所有动物摘眼球取血,分离血清,测定肌酐(creatinine,CREA)、尿素(urea,UREA)、谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST),在生化指标层面确定有无肝肾损伤。

1.3.2皮下荷瘤鼠动物模型的建立 正常饲养待OS-732皮下荷瘤鼠皮下肿瘤生长直径达1 cm时处死,选择生长良好的肿瘤组织,用手术刀将肿瘤组织切割成3～4 mm3大小的组织块,以特制的组织接种器将肿瘤组织移植到BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下,待OS-732皮下荷瘤鼠肿瘤直径达到 0.8～1.0 cm后再进行体内实验。所有动物实验均符合医院动物管理和使用委员会的相关指导方针(贵州省人民医院伦理委员会批准号:2020384号)。

1.3.3PD-L1的免疫组化染色 取OS-732皮下荷瘤鼠的肿瘤组织行免疫组化染色。石蜡切片脱蜡处理,组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,血清封闭,加一抗二抗,DAB显色,复染细胞核,脱水封片,苏木精染细胞核为蓝色,DAB显出的阳性表达为棕黄色。

1.3.4124I-anti-PD-L1单克隆分子探针的制备 在1.5 ml EP 管中依次加入20 μl anti-PD-L1(5 mg/ ml)、200 μl PB(0.1 mol/L、pH 7.0)溶液和250 μl含74 MBq124I-I2的溶液,而后加入12 μl(1 mg/ml)NBS反应60 s,再向其中加入200 μl 10% HSA终止反应,最后PD-10脱盐柱纯化产物。

1.3.5Micro-PET/CT骨肉瘤PD-L1的成像 通过喂食0.5% KI溶液阻断荷OS-732骨肉瘤裸鼠甲状腺对碘的摄取,时间点为注射分子探针前3天。3只荷OS-732骨肉瘤的裸鼠尾静脉注射18.5 MBq124I-anti-PD-L1单克隆分子探针,并在注射探针后的相应时间点(注射探针后2、24 、48 h)进行Micro-PET/CT骨肉瘤PD-L1成像。

2 结果

2.1 Anti-PD-L1抗体毒性试验

2.1.1动物体质量变化 所有KM小鼠在给药期间活动、进食等一般状态良好,体质量均有一定程度的上升。首次给药当天记为D0,第8次给药后6 d,即D31,anti-PD-L1抗体组的动物体质量与PBS组相比差异无统计学意义(t=-5.8,P=0.58)。所有动物体质量变化情况见图1。

图1 给药后KM小鼠体质量变化趋势图

2.1.2HE结果 第8次给药后6 d,即D31,每组取3只动物的肝、脑、肺、肾4个组织,苏木精-伊红染色检测组织的病变情况,结果显示PBS组与anti-PD-L1组均无明显病变,典型HE染色结果见图2,其中肝(图2A、B):两组肝小叶结构正常,肝细胞索排列整齐,肝小窦结构清晰,均未见炎性细胞浸润及细胞变性坏死。脑(图2C、D):两组神经元染色成椭圆形或圆形,数量丰富,均排列规则致密,基质丰富,染色均匀。肺(图2E、F):两组肺泡大小均匀,结构正常,均未见肉芽肿等明显增生,未见炎性细胞浸润及细胞变性坏死。肾(图2G、H):两组肾小球均匀分散在皮质内,结构完整,均未见明显病变;髓质内小管均未见明显病变。

图2 HE染色结果图 ×100A、C、E、G:PBS组;B、D、F、H:anti-PD-L1组

2.1.3生化指标结果 第8次给药后6 d,即D31,分别取PBS组与anti-PD-L1组KM小鼠外周血分离血清,比色法检测血清中CREA、UREA、ALT及AST的含量。结果显示,anti-PD-L1组KM小鼠各指标与PBS组差异无统计学意义。见表1。

表1 anti-PD-L1给药后KM小鼠各指标的变化情况

2.2 荷瘤鼠骨肉瘤PD-L1的免疫组化染色OS-732骨肉瘤荷瘤鼠动物模型成功构建(图3A),同时免疫组化染色(immunohistochemistry,IHC)证实骨肉瘤组织细胞膜表面的PD-L1受体蛋白表达为阳性,即PD-L1受体免疫组化染色为棕色(图3E)。

图3 OS-732骨肉瘤的Micro-PET/CT显像及IHC染色

2.3 PD-L1的Micro-PET/CT显像OS-732骨肉瘤荷瘤鼠在尾静脉注射18.5 MBq124I-anti-PD-L1单克隆分子探针2 h后开始进行Micro-PET/CT肿瘤显像。根据肿瘤成像,可以看到在荷瘤鼠肿瘤部位没有明显的摄取,肿瘤区域未出现显像,分子探针主要聚集在荷瘤鼠的心脏和肝脏中(图3B)。当Micro-PET/CT成像在注射后24 h时,在骨肉瘤部位可以观察到明显的探针摄取,肿瘤区域已经出现了清晰的成像(图3C)。探针注射后48 h,荷瘤鼠肝脏中的残留探针基本被代谢完毕,骨肉瘤部位表现明显的高摄取(图3D), 整个肿瘤成像清晰。

3 讨论

PD-L1的肿瘤成像是一个热门研究方向[5-6],与免疫有关的成像主要包括SPECT、PET、光学成像和MRI。每种成像方法在展示肿瘤形态和生理方面都有其固有的优缺点。该研究表明124I-anti-PD-L1单克隆分子探针可用于体内行靶向PD-L1受体蛋白的无创PET成像。

该研究通过毒性实验验证anti-PD-L1对动物无明显毒性,还通过免疫组化实验验证了PD-L1蛋白受体在OS-732肿瘤组织中的表达,并为进一步的成像实验准备了可靠的肿瘤动物模型。骨肉瘤荷瘤鼠通过尾静脉注射124I-anti-PD-L1分子探针24 h后,肿瘤部位出现了良好的成像,这样也就可以实现对肿瘤的PD-L1受体的无创实时监测,这种非侵入性成像具有简便快捷,而且精准度高的优点。

目前用于检测肿瘤组织中PD-L1表达的传统方法都是侵入性的,例如IHC或Western blot。另外,当获取肿瘤标本时,存在医源性肿瘤播散的风险。Kim et al[7]研究表明PD-L1受体蛋白在肿瘤中的存在,而PD-1蛋白主要在肿瘤浸润的淋巴细胞中表达。大多数免疫疗法的基本机制是激活免疫效应物,例如T细胞和自然杀伤细胞。但是,免疫检查点抑制剂,例如PD-1、PD-L1和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4),它们均能抑制T细胞的功能并促进免疫逃逸。纳武利尤单抗(nivolumab)是一种抗PD-1/PD-L1检查点抑制剂,但是只有在15%～24%的患者中有效,可能与患者体内相关受体蛋白表达量少有关。目前还没有发现包括PD-L1在内的并经过验证的能够准确识别的可能对免疫检查点疗法产生反应患者的生物标志物[8]。抗PD-L1治疗仅对某些患者有益。PD-1/PD-L1能够抑制抗肿瘤免疫力,因此,在临床环境中阻断PD-L1受体蛋白可能会导致一部分患者发生强烈的抗肿瘤反应[9]。服用抗PD-L1药物后的患者,在常规治疗后会得到更好的无进展生存期[10]。

综上所述,PD-L1的非侵入性成像意义重大,因为免疫疗法在PD-L1阳性患者中更有效,筛选具有潜在PD-L1表达的肿瘤患者可进一步帮助患者的免疫治疗。此外,这项研究采用核医学技术对患者的PD-L1受体蛋白表达进行无创筛查提供了新的探针,有望提高患者对PD-L1免疫治疗的反应率。该研究表明,124I-anti-PD-L1分子探针可能为广大骨肉瘤患者选择PD-L1免疫治疗提供新的策略,同时也将为该课题组进一步的免疫治疗研究奠定基础。