胶体金试纸条检测沙门氏菌的综合实验与研究

周丽（南昌市青云谱区疾控中心,江西 南昌 330000）

食源性致病菌是影响食品安全最为主要的因素，因此为了能够快速检测出食源性致病菌，需要采用更为简洁、快速的技术，以为治疗食源性致病菌提供便利。目前应用于实际检测的方法为酶联免疫吸附、聚合酶链式反应等，虽然这些方法的可靠性具有一定的保证，但是实验耗时长，无法满足临床检测的需要。为此，为了能够快速地检测出沙门氏菌等食源性致病菌，可利用具备生物亲和性的纳米金对沙门氏菌抗体进行检测，通过对检测线的捕捉，判断颜色条带，实现对沙门氏菌的定性和定量检测。

1 胶体金试纸条检测沙门氏菌综合实验准备

胶体金技术是一种极为常用的分析技术，本实验主要采用纳米金技术，借助胶体金的稳定性和灵敏性制备试纸条，对沙门氏菌进行现场检测和临床试验。

1.1 主要应用试剂 本次实验应用的试剂为二水合柠檬酸三钠、氯金酸、碳酸钾、盐酸。实验所有试剂均购自长期合作的化学试剂公司。同时，本次实验还应用了来自菲鹏生物股份有限公司的羊抗小鼠二抗，而沙门氏菌抗体则购自长期合作的Abcam公司[1]。此外，在开展实验的过程中，还需用到牛血清白蛋白、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。为了保证实验的效果，需要借助样品垫、结合垫和NC膜。

1.2 主要仪器 实验应用的仪器包括对抗体以及试剂进行重量称量的电子天平，用于观测抗体变化的离心机、投射电镜，以及用于观测实验颜色变化的紫外光光度计。在实验过程中，还需应用对试剂搅拌、样品混合的控温磁力搅拌器、恒温振荡器、高速切条机。待实验结束后，利用超声波清洗器对所有实验器具进行清洗。

1.3 纳米金制备 本次实验主要采用柠檬酸钠还原法对纳米粒子进行合成。利用浓度为0.029mol/L的氯金酸钠溶液与超纯水进行混合，并将混合后的溶液添加至200ml的三口烧瓶中，利用磁力搅拌器对其进行搅拌并加热，直至将溶液煮沸。并在最短时间内向煮沸的溶液中添加新鲜配置的柠檬酸钠溶液，将混合溶液进行加热回流，待15min后停止加热，将其放置于4℃的环境中进行储存，以备后续实验使用[2]。

1.4 NC膜组装 对沙门氏菌单抗进行检测，需要将其与羊抗鼠结合后，利用PB溶液对其进行稀释，以便能够在后续实验的过程中利用三维划膜仪对沙门氏菌单抗进行检测。在对其进行检测的过程中，要将沙门氏菌与单抗鼠结合放置于NC膜的划线位置，以便能够保证检测线和质控线对实验体进行检测。此外，在进行检测前，需将划好线的NC膜放置于温度为37℃的鼓风干燥箱中，静置2.5h后，再对其进行烘干，将NC膜密封，保存在干燥处。

1.5 试纸条组装 试纸条的组装需要用到样品垫和吸水纸，利用数控裁条机将样品垫和吸水纸裁成的规格大小为200mm×20mm，并将NC膜贴附于PVC底板上，使得被贴合后的NC膜能够接近检测线一端，待两者重合后，保证其缝隙小于1mm，再将样品垫紧紧贴合至PVC底板上，并保证其与结合垫结合的厚度在2mm左右。同时，将与吸水纸重合后的NC膜贴合至靠近质控线的一端。待上述步骤完成后，对其进行切割，切割至大小为3mm×6.5cm的试纸条，并将其放置于存有干燥剂的自封袋中。

2 胶体金试纸条检测沙门氏菌综合实验探究

利用胶体金试纸条对沙门氏菌进行检测，需要在进行检测前制定完备的检测方案，基于沙门氏菌的检测原理，在特定条件下对其进行检测。在进行检测的过程中，应当针对不同浓度的沙门氏菌设计不同的检测方案，进行特异性和重复性实验。

2.1 检测原理 胶体金试纸条对沙门氏菌进行检测，主要是基于抗体的免疫反应以及层析作用，利用纳米金探测针实现对沙门氏菌的识别。在进行检测的过程中，在毛细作用的帮助下将纳米金与沙门氏菌的混合溶液自NC膜向吸水纸方向推动。待沙门氏菌与纳米金混合后到达质控线时，其会被处于质控线的沙门氏菌抗体捕获，从而形成鲜明的颜色条带。而一直处于游离状态的纳米探针则会继续向前移动，待其被检测线上的沙门氏菌抗体捕获后，会再次形成颜色条带[3]。但是如果样品中并未含有沙门氏菌，则只能依靠检测线的二抗作用进行显色。如在检测后试纸条上的检测线和质控线都显色，则表示样品中含有沙门氏菌。当只有检测线显色时，则表示样品中并不含有沙门氏菌。而如果质控线不显色，则表示纳米金金属探针不能与检测线进行二抗结合，表示实验失效。整个实验无需采用大型仪器，只需裸眼就可分辨沙门氏菌的存在。

2.2 检测方案 首先，提取大约50μL的沙门氏菌样品，将其放置于微孔板中，并在样品中添加纳米金探针，再向其中添加浓度为2%的重悬液，待其体积达到100μL后，使其进行10min的孵育。其次，将试纸条样品垫插入混合后的溶液中，待溶液层析出爬条后，再将其放置于微孔板中，并再次加入50μL的重悬液，利用重悬液对爬条进行清洗。最后，将其静置20min后，观察爬条的显色情况，并利用智能手机进行拍照留存，通过Image软件对检测线上的灰度值进行测量，将其标志为检测信号，记录样品的灰度值和空白样品的灰度值，以备后续使用。

2.3 检测条件 构建沙门氏菌的检测条件，需要采用单因素变量法，利用其对检测条件进行优化，以便使沙门氏菌在最优条件下进行检测。在进行实验的过程中，要事先观察爬条的显色情况，利用已经测定的灰度值计算出检测沙门氏菌的最优条件。将所有阳性沙门氏菌的浓度都设定为107CFU/ml，并在所有实验体中添加同体积的磷酸缓冲溶液，反复进行3次实验。此外，利用封闭探针测定BSA浓度，记录探针所采用的抗体量，以便能够对其进行优化。在进行检测过程中，将BSA浓度设置为1%、4%、6%三个浓度，利用修饰探针检测应用的抗体量。

2.4 不同浓度沙门氏菌检测 在对0.5×104、1×105、2×106、3×107等不同浓度的沙门氏菌进行检测时，需要观测不同样品的显色情况，再确定裸眼检测时限，通过测定样品的相对灰度值，使得样品浓度能够达到拟合标准曲线，从而确定不同浓度沙门氏菌的半定量范围。

2.5 特异性考察 在最佳条件下进行考察，其能够检测样品中107CFU/ml的沙门氏菌、大肠杆菌和李斯特菌。在进行实验的过程中，将不同体积的缓冲溶液与空白样品对照，并重复进行3次实验，待实验结束后，观察每组实验体的显色情况，并对实验体的灰度值进行测量，比对各组实验体的灰度值信号。

2.6 重复性考察 在整个实验中抽取9个沙门氏菌的实验样品，利用9个试纸条对不同浓度的沙门氏菌进行测试，并与阴性样品进行对照。并且在进行检测的过程中，要设置不同的探针量，可以将探针量设置为5μL、10μL、11μL、132μL，将其置于最佳条件下，对其不同浓度的沙门氏菌进行检测，将试纸条放置于温度为4℃的环境中，检测阳性样品和隐性阴品，通过对阳性样品和阴性样品之间检测结果的对比检验试纸条的有效性，并依照比对结果计算回收率，再利用得出的回收率确定试纸条的实际检验结果。

3 胶体金试纸条检测沙门氏菌综合实验结果分析

在利用胶体金试纸条对其进行检测完毕后，通过分析纳米金表征、沙门氏菌靶向生物探针表征分析沙门氏菌的存在情况。并且在最优条件下，对胶体金试纸条性能和特异性结果进行分析。

3.1 纳米金表征 根据实验结果显示，纳米金在检测完毕后呈现出酒红色，通过与紫外可见光谱的对比可以看出处于521nm处的纳米金粒子正处于吸收峰[4]。基于对透射电镜图的分析，可以明显看出金纳米粒子呈现出球形形状，且通过对其尺寸的观察可以看出金纳米粒子尺寸均匀，且并无明显的团聚现象。在对200个颗粒粒径进行统计测量后，可得出金纳米粒子的平均粒径可达到14.0nm。

3.2 沙门氏菌靶向生物探针表征 在对沙门氏菌进行检测时，将其置于接近蛋白质电点或是偏碱的条件下进行测量。在进行检测过程中，将蛋白质与金纳米粒子进行混合，使得二者形成牢固的结合物。首先，将其置于带电负电荷中，通过与蛋白内氨基酸的结合，使得其中的负电荷能够与正电荷相互吸引，以便实现对于沙门氏菌的分离。其次，通过与蛋白的结合，使得蛋白中的氨基酸残基能与金纳米粒子表面发生疏水吸附，从而实现与金元素配位结合。通过检测，可以看出沙门氏菌抗体中所携带的铁元素中含有赖氨酸、色氨酸等，且能够吸附至金纳米粒子表面，进而发挥生物识别功能。待修饰抗体后，纳米金探针在与沙门氏菌接触后仍旧呈现出酒红色。与紫外光谱对比后可以发现，修饰纳米金呈现出红移现象，且在经过透射电镜检测后，纳米金仍旧为球形且并未出现团聚现象。因此，通过该结果可以判断出，修饰对于纳米金的光学性以及形貌并不会产生影响，其反而能够进一步验证沙门氏菌的抗体活性。

3.3 最优检测条件 通过对BSA浓度、修饰抗体量以及探针用量的分析可以判断出其对于探针的影响。根据图谱显示，BSA浓度在用于分析金纳米粒子表面时，未发现与抗体结合的位点，并未展现出明显的特异性。但是在高浓度BSA信号释放后，随着浓度的增大，其中的沙门氏菌含量逐渐减少，通过裸眼对检测线显色情况的分辨可以看出有微弱的显色反应，即可以判断出存在非特异性吸附的情况。同样，通过对表面抗体修饰量的检测可以发现，随着修饰量的增多，其中的沙门氏菌会逐渐增大，待至修饰量达到2μg后，如继续加大抗体用量，则不会呈现出明显变化，因此可以判断出2μg抗体是探针用量与细菌结合的临界值，在此范围内会使得显色加深，但是一旦用量超出2μg的范围，灰度值反而会出现下降的情况。

3.4 性能分析 在最优的检测条件下，其主要考察了裸眼定性检测限值以及灰度值的半定量范围。在进行检测的过程中采用该种方式能够检测不同浓度的沙门氏菌，待观测到检测线呈现颜色条带后，其质控线并未出现显色情况。而随着沙门氏菌浓度的不断增加，在增加至1×10CFU/ml时，质控线则会微弱地显示出紫红色条带，待检测限超出1×10CFU/ml后，随着浓度的提升，条带颜色会逐渐加深。同时，在Image软件的检测下，质控线的相对灰度值会随着细菌浓度的提升逐渐提高，呈现出线性的关系，能够被用于半定量分析。

3.5 特异性结果 在采用几种常见的细菌对该种方法的特异性进行测定后，发现将该种方法应用于检测沙门氏菌，其在检测线和质控线上都呈现出了明显的颜色条带，而其他几种常见菌种则并未呈现出明显的颜色条带。一些常见的菌种甚至只是在检测线上出现明显的颜色条带，基本与空白样品组相持平。通过对沙门氏菌的相对灰度值的检测可以发现，沙门氏菌的灰色值信号明显高于其他细菌组，虽然常见细菌组的灰度值信号比空白样品组略大，但是可以明显看出其远远低于沙门氏菌，因此采用这种方式是进行沙门氏菌检测的最好方式。

总而言之，在本次实验中，通过制备纳米金的方式，利用抗原抗体的免疫反应和层析作用对沙门氏菌进行检测，简化了沙门氏菌的检测步骤，实现了对于沙门氏菌定性以及定量的判断。在整个实验过程中，并未使用复杂的仪器，且实验成本极为低廉，而且本次实验还囊括了化学、生物、医学等多个学科知识，有助于提升实验的综合性，保证实验效果。本次实验主要立足于纳米科技，通过对病原体的检测，得出了精准的实验结果，为后续的科学研究奠定了基础，促进了多学科的良性循环，增添了实验的综合性。