冰淇淋中益生菌存活率影响因素和保护技术研究进展

余俊杰，韩刚，周志磊,3，唐俊*，毛健,3

1.阜阳师范大学生物与食品工程学院（阜阳 236037）；2.江南大学食品学院，粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心（无锡 214122）；3.江南大学（绍兴）产业技术研究院（绍兴 312000）

冰淇淋是一种具有诱人风味和细腻口感的冷冻饮品，据统计，2017年全球冰淇淋市场总市值为570亿美元，并且将在2024年达到750亿美元[1]。冰淇淋有着广泛的消费群体（儿童，成年人甚至是老人）、合适的营养成分（糖类，蛋白质和脂肪）以及良好的理化性质（偏碱性）。随着消费者对健康饮食需求的增加[2]，越来越多的功能性冰淇淋问世，如低热量的代糖代脂冰淇淋[3-4]、益生菌冰淇淋[5]和能满足一些有着特殊营养需求如糖尿病患者等特殊群体的功效成分冰淇淋[6]等。益生菌冰淇淋是指添加了有益的活性微生物的冰淇淋，这些活性微生物有着改善人体肠道微生物环境[7]、预防龋齿[8]、改善消化[9]等丰富的保健功效。

通常益生菌冰淇淋需要在其保质期内保证自己的活益生菌数量在～CFU/g[10]以上，但因为冰淇淋的生产过程、储藏条件以及原材料的特性都可能会对益生菌造成伤害，所以需要充分考虑益生菌存活率的影响因素和采取一定的保护技术。

1 影响益生菌存活率的主要因素

1.1 生产原料的影响

作为冰淇淋的主要原料和益生菌存活的主要载体，乳品的种类对于益生菌存活率有着重要的影响。原料乳可以提供营养配比均匀的蛋白质、脂肪和碳水化合物（主要是乳糖）。目前，用于制作冰淇淋的原料乳已经不再局限于牛奶，关于以绵羊奶[11]、山羊奶[12]和骆驼奶[13]等动物奶为原料制作的冰淇淋的尝试都在不断开展。并且其中山羊奶相比牛奶具有固形物含量高、加工过程中无需均质化以及脂肪含量高等优势。除了动物乳以外，一些植物乳也可以作为冰淇淋的原料，Aziz等[14]利用大豆加工的豆乳制作冰淇淋，豆乳具有pH适中，总固形物含量高并且含有益生元寡糖（大豆低聚糖）等特点，该试验结果中，大豆冰淇淋中益生菌在冷冻后180 d内活菌数下降趋于稳定，始终在106CFU/g之上，表明豆乳是益生菌的合适载体。

冰淇淋中通常会添加一些水果作为风味配料，这样不仅可以改善冰淇淋的口感，也可以增加冰淇淋的营养价值。一些水果冰淇淋如桃金娘果[15]，葡萄和核桃[16]都已经被证明对食物中的益生菌的存活率有影响。这种影响的主要方式可能是果肉中的一些有机酸和糖分改变产品的pH和化学环境。Kavas[17]在用骆驼奶制成的冷冻酸奶中添加了草莓和番石榴，增加了冰淇淋中嗜酸性乳杆菌的存活率（Lacticaseibacillus casei431）。El-Shenawy等[18]在冰淇淋中添加了老虎果提取物，结果表明，用50%老虎果提取物替代水生产冰淇淋效果最好，在提高了益生菌菌株的存活率的同时，还改善了冰淇淋的理化性质。风味配料对于冰淇淋理化性质和生物学环境的影响是多种多样不可忽视的，所以具体的风味配料对冰淇淋中益生菌存活率的影响可能还是需要单独考察。

甜味剂也是冰淇淋的重要配料，其类型和浓度也可能对益生菌存活有影响。Pay等[19]观察到，添加了未精制椰子棕榈糖的冰淇淋相比使用精制蔗糖的产品呈现出更高的益生菌存活率。此外，试验结果还表明添加18%糖的产品比添加15%或21%糖的产品具有更高的益生菌活力。这可能是由于高糖分会造成比较强的渗透压，从而不利于益生菌的生存，而糖分过少则会无法满足益生菌的碳源需要。用多元醇如赤藓糖醇、木糖醇、异麦芽酮糖醇和麦芽糖醇作为甜味剂的冰淇淋中冷冻和储藏过程后益生菌数量都保持在较高的水平[20]，但是赤藓糖醇的添加会导致冰淇淋的硬度变小，从而使口感变差。

此外，配料中如果添加了膳食纤维或者其他益生元，同样可以显著地提升冰淇淋中的益生菌的存活率。Hanafi等[21]对植物乳杆菌（L.plantarum）进行了不同膳食纤维添加量的对比试验，试验结果表明，膳食纤维添加量最高的一组中益生菌的存活率也越高，这可能是因为膳食纤维可以在益生菌生长过程中起到益生元的作用，并且膳食纤维本身具有一定的物理保护作用，能够保护益生菌免受冷冻损伤和机械应力的剪切以及在冷冻混合过程中的冻伤。

1.2 生产工艺的影响

冰淇淋中大部分益生菌都是微氧或者厌氧的，因此，氧气的含量对于益生菌的存活率有着重要的影响[22]。此外，在冷冻过程中氧气会对膜脂和细胞蛋白质造成损害[23]。此外，如果溶解氧进入了厌氧的益生菌细胞内，就会导致毒性含氧代谢物（如超氧阴离子）在细胞内积累，从而降低益生菌的生存能力[24]。

由于冷冻过程中冰晶的形成，细胞在冷冻过程中所受到的伤害通常比低温储存时受到的伤害更大[25]。冷冻过程中不仅形成的冰晶会对细胞膜造成机械伤害，短时间的温度下降也会导致细胞蛋白质变性和细胞膜的结构损伤。由于冰晶的形成，液体形态的游离水会减少，从而升高细胞内物质浓度，甚至可能会发生质壁分离，最终导致细胞膜的破裂[23]。不同的降温速度对于冰晶形成的大小具有一定程度上的影响，快速冷冻会产生数量多的小冰晶；而慢速冷冻则会产生大冰晶[26]。但是这并不能保证快速冷冻一定可以提升益生菌的活性，Baati等[27]的试验表明，在一些情况下预冷冻和慢速冷冻可以提升细胞对低温的抗性。相比直接快速降温的对照组，经过低温孵育6 h的试验组的存活率和活性更高。尝试分阶段降温的方法可能也是规避冷冻时益生菌损失的一种方法。

冰晶形成对于不同的益生菌所造成的伤害也不同，Sheu[28]对保加利亚乳杆菌的两个代表菌株（L2和rr）进行了冷冻试验，结果发现在同样的条件下，细胞体积比较小的L2的存活率（45%）远高于细胞体积比较大的rr的存活率（5%），所以选用细胞体积更小的益生菌可以减少它们在冷冻过程中受到的机械损伤。

1.3 储藏温度的影响

冰淇淋通常都需要长期的低温储藏，储藏过程中的低温会抑制益生菌的生长和繁殖，并且在大部分情况下冰淇淋的储藏温度都会有一定幅度上的变化。Ullah等[29]通过对马铃薯细胞进行4个不同冷冻储藏处理（恒温-80 ℃；在-17～-16，-17～-11和-17～-7 ℃之间波动）观察温度变化对冰晶粒度分布的影响。结果表明，细胞和细胞间隙中的晶体生长也受到储存期间温度变化的影响，随着温度波动幅度的增加，冰晶的生长也会越大，从而对细胞的损伤也越大。Park等[30]发现不同的储藏温度对冰晶的生长也有一定的影响，在长达52周的贮藏期间，4种储藏温度（-18，-30，-50和-70 ℃）下的冰淇淋冰晶尺寸有不同的变化。其中-18 ℃下的冰淇淋冰晶尺寸增长的幅度最大，从40.3 μm增长到了100.1 μm，而-50 ℃和-70 ℃下的冰淇淋冰晶则是从40.3 μm增长到了57～58 μm。并且不仅是只有在-50 ℃或者-70 ℃的温度下，即便是在-10 ℃和-20 ℃的差别下，细菌的存活率也有着显著的差别[26]。

1.4 其他影响

益生菌的种类也可能会影响到最终的存活率。与双歧杆菌相比，乳杆菌对有害条件有着更高的抗性[31-32]。Ferraz等[33]研究了不同冰淇淋的膨胀率对益生菌存活的影响，结果表明低膨胀率的冰淇淋中嗜酸乳杆菌的活性相对较高。益生菌的冷冻应激机制虽然未被探明，但是Streit等[34]在提高保加利亚乳杆菌的耐冷冻能力的试验中发现，经过30 min酸化预处理的乳杆菌有着更好的抗冷冻性能，说明一些乳杆菌的酸应激和冷应激机制可能存在一定程度上的关联。

2 益生菌保护技术

2.1 微胶囊化

微胶囊技术是利用特殊材料通过乳剂、喷雾干燥、电喷雾和反乳化等微胶囊化手段[35-36]，将目标物包裹在很小的微型胶囊壁内的一种包装技术。这项技术应用在保护冰淇淋中的益生菌时也同样表现出良好的效果。Afzaal等[37]用海藻酸钠和卡拉胶作为材料对益生菌细胞进行包封，显著地提高了益生菌的存活率和活力。而Zanjani等[38]对比了采用海藻酸钙、小麦、大米、玉米淀粉、壳聚糖和聚赖氨酸不同材料作为微胶囊涂层对益生菌存活率的影响。结果表明，低聚糖和聚赖氨酸作为涂层的微胶囊方案优于采用淀粉作为涂层的方案，而淀粉中，玉米淀粉的效果又优于小麦和大米淀粉。除此之外，乳清浓缩蛋白、海藻酸钙[39]和魔芋葡甘聚糖水解物[40]也可以用作冰淇淋微胶囊的壁材。总的来说，与游离细胞相比，微胶囊化促进了益生菌在加工和储存过程以及模拟肠道中的存活率的提高，主要是保护益生菌免受水结晶所造成的伤害，并且增加了厌氧的益生菌对氧气的抵抗[35]，从而起到了保护益生菌的效果。

2.2 冷冻保护剂

向细菌悬液中添加冷冻保护剂是最常见的保护手段之一。一般情况下冷冻保护剂都是水溶性的，可以降低冰的熔点。当冰晶开始形成时，益生菌会被固体冰晶挤到还没有结冰的水溶液中，所以如果添加冷冻保护剂，那么相当于扩大了未结冰的部分区域，也就给了益生菌更多的生存空间，从而降低益生菌机械压力和渗透应力的损伤[41]。一些糖类被证明有冷冻保护剂的功能，Chen等[42]研究了冷冻干燥对开菲尔酸奶中微生物存活的影响，并测定了冻干前添加到开菲尔中的冻干保护剂（半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖）对益生菌存活率的影响。结果表明，添加10%半乳糖或蔗糖作为冷冻保护剂显著提高了乳酸菌和酵母菌的存活率。赖田甜等[43]向含有益生性植物杆菌YW 11的冰淇淋中添加了低聚果糖，结果发现这不仅能提高益生菌的整体活性，也可以改善冰淇淋的理化性质。

除了水溶性的保护剂之外，饱和单甘酯结构乳液也可以作为冷冻保护剂。在这种复杂结构中的细菌可能将其自身普遍地置于单酸甘油酯晶体结构附近的水性区域中，在那里它们可以找到一些疏水的营养物质并且承受更小的环境压力，从而起到保护益生菌的效果[44]。

2.3 其他保护技术

除了微胶囊化益生菌和向冰淇淋中添加冷冻保护剂之外，还有一些其他技术也可以提升益生菌的存活率。比如Terpou等[45]采用微生物固定化技术，将益生菌干酪乳杆菌ATCC393固定化在沙棘果中并添加到冷冻酸奶里面，经过90 d/-18 ℃的低温储藏之后，益生菌存活率仍然处于较高水平，而对照组游离益生菌细胞的存活率则下降了10%。但并非所有的益生菌固定化都可以提升益生菌存活率。Pornpan[46]以香蕉粉为载体固定化益生菌，采用益生菌Lactobacillus caseiTISTR 1463和Lactobacillus acidophilusTISTR 1338所制作的冰淇淋经过低温储存后的益生菌存活率和对照的游离益生菌组并没有显著差异。所以应当充分考虑菌种和固定化载体对固定化保护效果的影响。益生菌在低温环境下的抗冷冻胁迫机制还未被探明，因此添加一些能够刺激细胞活性的辅酶也有可能提高细胞的活性。比如有向冰淇淋中添加抗坏血酸的研究，结果表明抗坏血酸可以刺激冰淇淋中嗜酸乳杆菌等益生菌的生长，这可能意味着一些维生素也具有一定的益生菌保护作用[47]。

3 结语与展望

益生菌的存活很大程度上取决于它的食品基质，所以在益生菌冰淇淋的生产时应充分考虑乳品种类和配料对益生菌存活率的影响，针对特定的益生菌菌种进行冰淇淋配方的优化是有必要的。大部分益生菌都是厌氧菌，所以在冷冻搅拌时应当控制氧气含量，防止益生菌氧中毒。在冷冻成型阶段，温度变化速度会刺激益生菌的低温胁迫机制和导致冰晶形成对益生菌造成的物理损伤，所以不能够盲目的加快降温速度，具体工艺参数还需试验进行优化。此外，在储存过程中应当尽量避免温度的大幅度波动。

一些益生菌保护技术如微胶囊化和添加冷冻保护剂等方法都已经被证明在益生菌冰淇淋生产中可以有效的提高益生菌的存活率，但是具体的微胶囊化方法和冷冻保护剂的类型对于不同冰淇淋中益生菌的存活率的影响还没有得到有针对的研究。

冰淇淋市场的竞争日趋激烈，低热量、功能化和口感好的新型益生菌冰淇淋将会成为市场追逐的热点。但关于冰淇淋中益生菌的损伤机制的探究目前还停留在起步阶段，具体生产过程中加工工艺的各个环节与益生菌损伤之间的联系还有待进一步的明确。