一种提升阿卡波糖发酵水平的补料控制方法

俞晓芸,李 娜,高双玉

(杭州中美华东制药有限公司,浙江 杭州 310011)

作为一种微生物发酵产品,阿卡波糖是游动放线菌(Actinoplanessp.)发酵产生的C7N-氨基环醇类的假性四糖物质,因其可与α-葡萄糖苷酶发生竞争性抑制作用而被广泛应用于2型糖尿病的治疗,能有效降低糖尿病患者的餐后血糖[1-3]。

随着医药市场新政策的实施,产品的技术水平提升和生产成本降低是提高产品市场竞争力的重要因素。在工业化生产中,微生物发酵产阿卡波糖存在周期较长、水平较低的问题。在发酵中后期,菌体的衰老使得产物合成速率降低已成为阿卡波糖发酵生产中需要解决的一个重要问题。在发酵中采用合适的补料工艺可以有效提高菌种的生产能力,分批补料发酵的关键是对补料控制方法的优化[4-5]。笔者的研究目的是根据菌种的特性,调整发酵过程中的补料工艺控制参数,以提高其发酵水平。碳源和氮源是微生物生长代谢的主要原料,根据阿卡波糖的生物合成途径,葡萄糖和麦芽糖作为合成原料直接参与阿卡波糖的合成,在控制葡萄糖质量分数的同时维持麦芽糖质量分数在适当的水平可促进阿卡波糖的合成[6-10]。陈学军等[8]在发酵培养基和补料培养基中选用麦芽糖和葡萄糖,且当其配比为m(麦芽糖)∶m(葡萄糖)=3∶1和4∶1时,最利于阿卡波糖合成;姜玮等[9]研究表明:当麦芽糖质量分数小于6.0%时,发酵效价随麦芽糖质量分数的上升而提高。另有研究显示[11-13]:阿卡波糖的生物合成与补料培养基中氮源的种类和质量分数有密切关系,适宜的氮源补加有助于延缓菌体衰老,提升发酵水平。张琴等[12]研究发现:在阿卡波糖发酵过程中补入谷氨酸钠并维持一定浓度,能提高阿卡波糖发酵单位;魏淑梅等[13]研究发现:在阿卡波糖发酵30～60 h时,单次或多次补入3.0%～3.6%麦芽糖可以显著提高发酵单位,同时补加少量酵母膏有助于维持菌体正常生长。阿卡波糖是犹他游动放线菌的次级代谢产物,其生成与菌体生长具有相关性,在发酵前中期,菌体大量生长,可以较快进入次级代谢,产物合成速率较高,而在发酵后期,菌体开始衰老[14]。笔者在摇瓶水平上探究碳源及碳源、氮源复合补料对产阿卡波糖的影响,通过延缓菌丝衰老、维持较高的产物合成速率,进一步提升阿卡波糖的发酵水平,并为工业化发酵产阿卡波糖的补料优化控制提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

实验所用阿卡波糖产生菌为犹他游动放线菌,菌株编号:AK-07,笔者公司保藏。

1.1.2 培 养 基

固体培养基:黄豆粉1.5 g,葡萄糖2.0 g,蛋白胨0.5 g,CaCO30.15 g,琼脂1.5 g,用纯化水定容至100 mL,pH调节至6.8～7.0,121 ℃高压灭菌30 min。

种子培养基:黄豆粉2.0 g,土豆淀粉1.5 g,葡萄糖1.5 g,酵母浸出粉0.1 g,CaCO30.2 g,用饮用水定容至100 mL,pH调节至7.0,121 ℃高压灭菌30 min。

发酵培养基:麦芽糖3.00 g,葡萄糖4.00 g,黄豆饼粉2.00 g,棉籽粉0.30 g;味精0.25 g,CaCl20.35 g,FeCl30.15 g,K2HPO40.20 g,CaCO30.25 g,用饮用水定容至100 mL,pH调节至6.8～7.0,121 ℃高压灭菌30 min。

补料培养基:葡萄糖30.0 g,加入饮用水,加热溶解后定容至100 mL,115 ℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器设备

脉动真空灭菌柜,XG1.GMX-0.36,购自山东新华医疗器械股份有限公司;恒温培养箱,ZXSD-R1160,购自上海智诚分析仪器制造有限公司;超净工作台,SW-CJ-2F,购自苏州安泰空气技术有限公司;恒温培养振荡器,ZWYT-9200,购自上海智诚分析仪器制造有限公司;低速离心机,SC-3616,购自安徽中科中佳科学仪器有限公司;显微镜,CX21,购自奥林巴斯;高效液相色谱仪,Agilent1260,购自安捷伦;10 m3发酵罐,规格为3.6 m×1.8 m,1.0 m3发酵罐,规格为1.8 m×0.9 m,均购自杭州赛富特设备有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 摇瓶发酵

1) 种子培养

用接种铲挖取0.5 cm×1.0 cm大小的斜面培养物,接种于装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中,于28 ℃在摇床上以250 r/min转速振荡培养48 h,制得种子培养液。

2) 发酵培养

将1)中种子培养液按10%接种量(以质量计,下同)接至装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,30 ℃,250 r/min振荡培养7 d。

3) 补料控制

在发酵的72,96,120 h时分别补加碳源(葡萄糖和麦芽糖)、不同种类氮源及复合氮源,考察补料工艺对阿卡波糖发酵的影响。每组补料体积相同,补加量以质量分数计,均为补加后的发酵液中各组分的质量分数。

图1 补料培养基优化过程示意图Fig.1 The optimization process of feeding medium

1.2.2 相关参数的分析

阿卡波糖发酵单位的测定[15-16]:采用HPLC法测定,色谱柱为氨基柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为V(pH为6.0的0.01 mol/L磷酸缓冲溶液)∶V(乙腈)=30∶70,流速为1.5 mL/min,检测波长为210 nm,柱温为35 ℃,进样量为10 μL。

菌体体积分数的测定:取发酵液10 mL于离心管中,3 500 r/min离心7 min,将上清液倒入另一10 mL离心管中,量取上清液的体积V1,菌体体积分数Q计算式为

Q=[(10-V1)÷10]×100%

2 结果与分析

2.1 补加麦芽糖对阿卡波糖发酵的影响

以菌株AK-07在发酵过程中的原补料工艺为对照组,原补料工艺为在摇瓶发酵72,96,120 h时分3次补入3.0%葡萄糖。实验在对照组基础上补加麦芽糖,在72,96,120 h时间点分别补加不同质量分数的麦芽糖(1.5%,3.0%,5.0%),从发酵第3天开始放瓶检测效价,直至发酵培养至7 d结束。重复3批摇瓶实验,取平均值,相对标准偏差(RSD)小于5%,结果如图2所示。

图2 补加不同质量浓度麦芽糖对阿卡波糖发酵的影响Fig.2 Effect of maltose supplementation with different mass fraction on acarbose fermentation

图3 发酵液中麦芽糖质量分数Fig.3 The maltose mass fraction in fermenttation broth

由图2,3可知:1) 补加麦芽糖的质量分数对发酵的影响无明显差异。2) 对照组在发酵6 d后,效价不再增长且出现稍有下降的现象,可能与该菌株提前衰老以及自身糖代谢有关;实验组在3～5 d进行麦芽糖补加,结果显示在第4天效价会有一定提升,并在后期稳定增长,且补加3.0%麦芽糖的实验组在第7天达到7 000 μg/mL,可见补加麦芽糖对阿卡波糖发酵有利。3) 对照组发酵液中麦芽糖质量分数逐渐降低,实验组发酵液中麦芽糖有所积累,补加5.0%麦芽糖时,发酵液中麦芽糖补入量远大于消耗量,累积在发酵液中,麦芽糖质量分数过高不利于阿卡波糖的合成,此外,补加麦芽糖影响发酵液的渗透压,中后期渗透压过高也不利于产物的合成。

2.2 氮源种类对阿卡波糖发酵的影响

在发酵中后期AK-07菌株菌丝出现衰老,产物合成速率降低,后期效价增长缓慢或出现效价倒跌的情况。因此,在上述补料配方优化的基础上,考察在阿卡波糖发酵过程中(3～5 d)补加不同种类和质量分数的氮源,以减缓菌丝衰老,提高产物的合成量。对照组为只补加3.0%葡萄糖和5.0%麦芽糖,实验组A,B,C,D和E分别为在对照组的基础上补加黄豆粉、棉籽粉、蛋白胨、酵母膏和味精。发酵培养7 d,测定各实验组的效价,重复3批摇瓶实验,取平均值,RSD小于5%,氮源添加对阿卡波糖发酵的影响如表1所示。

表1 补加不同氮源对阿卡波糖发酵的影响

由表1可知:与对照组相比,补加黄豆粉和味精对阿卡波糖合成有一定提升,补加有机氮源黄豆粉和酵母膏对延缓菌丝衰老有作用,酵母膏在刺激菌体生长的同时明显抑制次级代谢中产物的合成。黄豆粉最适添加量为0.4%,产物合成量提升10.7%;味精的最适添加量为0.05%,产物合成量提升8.7%。

2.3 添加铵盐或味精对阿卡波糖发酵的影响

实验组是在补加葡萄糖和麦芽糖的基础上,分别添加铵盐、0.025%的(NH4)2SO4、0.05%的CH3COONH4和0.05%的味精,铵盐可用作氮源,并通过转氨作用合成谷氨酸,对比补加铵盐、味精对阿卡波糖发酵的影响,重复3批摇瓶实验,取平均值,RSD小于5%,结果如表2所示。

表2 补加铵盐、味精对阿卡波糖发酵的影响

2.4 补加复合氮源对阿卡波糖发酵的影响

2.1～2.3节的研究结果表明:补加葡萄糖后,再补加麦芽糖、黄豆粉、味精或(NH4)2SO4都对后期提升阿卡波糖效价有利,这些物质不仅能提供阿卡波糖合成的前体物质,而且能供给微生物生长代谢所需要的碳源和氮源,帮助延缓菌丝衰老,提高阿卡波糖发酵水平[17-20];此外,因味精与(NH4)2SO4添加后,对促进菌体生长,提高产物合成量的差异不明显,考虑生产放大后原料的成本和安全性,实验进行至72,96,120 h时分别补加复合氮源时选用黄豆粉和味精。重复3批摇瓶实验,取平均值,RSD小于5%,不同补料方案对阿卡波糖发酵的影响如表3和图4所示。

表3 不同补料方案对阿卡波糖发酵的影响

图4 不同补料方案对阿卡波糖发酵的影响Fig.4 Effect of different feeding schemes on acarbose fermentation

由表3和图4可知:补料配方为葡萄糖、麦芽糖和复合氮源时,后期效价跳幅平稳,7 d放瓶效价最优,达8 277 μg/mL,较单独加黄豆粉或味精分别提高6.6%,9.7%,且加入黄豆粉后,菌丝衰老情况有所改善,后期效价增长较对照高,发酵延长至第8天,效价平稳,未有明显倒跌。

2.5 补料控制工艺在中试中的应用

在中试放大实验中,分别在发酵72,96,120 h时补入优化后的补料配方,考察该补料工艺在菌株AK-07发酵产阿卡波糖中的作用。将菌株接种摇瓶种子培养后,首先接入种子罐培养,然后移种至10 m3发酵罐培养,接着分别培养至约72,96,120 h,最后补加按一定比例配方组成的葡萄糖、麦芽糖和复合氮源的补料。对照组为原补料配方,即只补加葡萄糖,实验组为优化后的补料配方,从培养第4天开始取发酵液检测阿卡波糖质量浓度,结果如图5所示。

图5 补料优化工艺在中试中的应用Fig.5 Application of feeding process in pilot test

由图5可知:在中试发酵中优化后的补料工艺能明显提高后期的发酵水平,发酵至第8天效价达8 048 μg/mL,较对照组提高20.4%,而对照组在发酵第7天发酵水平达到最高6 978 μg/mL,第8天发酵水平下降。因此,优化后的补料工艺较原工艺有明显优势。

3 结 论

AK-07菌株具备发酵前期产物合成速率较快的优势,然而在发酵后期会出现菌丝衰老的情况,导致后期效价增长速率减慢甚至出现倒跌情况。为提升发酵水平,笔者在摇瓶发酵中优化AK-07菌株发酵过程中补料培养基的成分与配比。实验结果表明:在发酵72,96,120 h时补加质量分数为3.0%的葡萄糖和1.5%的麦芽糖的基础上补加复合氮源(0.4%黄豆粉和0.05%味精),此时阿卡波糖的合成量最大,摇瓶发酵水平较只补葡萄糖和麦芽糖实验组提高13.4%,达8 227 μg/mL,在10 m3发酵中发酵培养8 d后,实验组发酵水平较对照组提高了20.4%。麦芽糖作为前体物质直接参与阿卡波糖的合成,发酵液中未被利用的麦芽糖参与维持发酵液的渗透压,然而较高的渗透压不利于产物的合成,因此发酵中后期需维持麦芽糖在适宜的质量浓度才能提高阿卡波糖的发酵水平;味精提供的谷氨酸是阿卡波糖中氮元素的来源,而和黄豆粉组合成复合氮源在阿卡波糖发酵中后期补入,能延缓菌丝衰老,提高后期阿卡波糖发酵水平。笔者优化了阿卡波糖发酵过程中的补料配方,针对这种本身具有较大产能潜力的菌种,该配方能延缓菌丝衰老,延长发酵周期,明显提升阿卡波糖发酵水平,为该菌种后续的工业放大生产提供了数据支撑,也为阿卡波糖生产菌种在工业化生产中提供了一种补料思路。