阿尔兹海默症患者外周血miR-19b-3p和PTEN的表达及临床意义

哈尼克孜·阿不都热依木, 王 燕, 努尔比亚·米尔扎木, 阿力木江·亚森

(1新疆医科大学第一附属医院健康管理中心, 乌鲁木齐 830054; 2新疆维吾尔自治区第四人民医院重症医学科, 乌鲁木齐 830000)

阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease,AD)是一种是持续性神经功能障碍,临床表现为记忆障碍、认知障碍等[1]。随着AD病情的发展,患者逐渐失去生活自理能力,严重者会出现幻觉、妄想等症状,影响患者身心健康,给家庭带来沉重的负担[2-3]。因此及时评估AD病情,制定有效的干预方案对于AD患者具有重要意义。磷酸酶及张力蛋白同源物(Phosphate and tension homology,PTEN)是目前公认的抑癌因子,PTEN编码的蛋白同时具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性,在细胞增殖周期及细胞发育中发挥重要作用。研究发现,PTEN在多种脑损伤中发挥一定的保护作用,能够改善认知功能,这可能与PTEN加速神经细胞的修复有关[4-5]。微小RNA(microRNA,miRNA)是存在于血液中的游离RNA,在多种疾病的诊断、预后预测中均发挥重要作用[6]。miR-19b-3p是一种具有调控基因表达的非编码分子,在血清中能够稳定存在,近年来研究发现,miR-19b-3p与大脑认知功能存在一定的联系[7]。miR-19b-3p在AD模型细胞及AD患者体内均呈低表达,对于AD的诊断具有一定参考价值[8]。PTEN和miR-19b-3p在AD的发生发展中均起到一定作用,但二者与AD病情严重程度是否具有相关性,目前尚无确切定论。本研究通过对不同严重程度AD患者的临床资料进行分析,探究miR-19b-3p、PTEN与AD严重程度的关系,以期为AD患者治疗方案的制定提供参考,现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2020年2月-2023年2月期间新疆医科大学第一附属医院健康管理中心和新疆维吾尔自治区第四人民医院重症医学科收治的97例AD患者为AD组,其中男性52例,女性45例,年龄60～85岁,平均年龄(70.85±5.28)岁,BMI为22～25 kg/m2,平均BMI(23.51±1.25)kg/m2;病程0.5～2年,平均病程(1.37±0.28)年;基础疾病情况:合并糖尿病者39例,合并高血压者44例,合并高脂血症49例。选取同期63例体检健康老年人为对照组,其中男性37例,女性26例,年龄60～85岁,平均年龄(69.63±4.86)岁,BMI为22～25 kg/m2,平均BMI(23.05±1.62) kg/m2。AD组与对照组一般资料(性别、年龄、BMI)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。AD组纳入标准:(1)参照《中国痴呆与认知障碍诊治指南》[8],患者均确诊为AD;(2)患者年龄>60岁;(3)患者饮食正常;(4)简易精神状态(MMSE)评分>13分;(5)患者均于本院进行治疗;(6)患者或其家属签署知情同意书。排除标准:(1)患有精神类疾病者;(2)合并其他脑部疾病;(3)近期接受认知功能训练者;(4)患有心、肺、肾功能障碍者;(5)患有恶性肿瘤者。本研究经新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区第四人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平的检测 采集对照组与AD组患者入院时的外周血液样本4 mL,3 000 r/min离心15 min,取上层血清加入Trizol采用miR试剂盒提取血清总RNA,采用分光光度法检测RNA浓度,根据PCR试剂盒说明书配置反应体系(上下游引物各1 μL,缓冲液5 μL,cDNA2 μL,SYBR 10 μL,纯水加至20 μL),以总RNA为模板,按照逆转录试剂盒说明书得到cDNA,再以cDNA为模板,参考荧光定量PCR试剂盒说明书进行扩增,反应步骤设置为:95℃ 30 s,95℃ 5 s,56℃ 20 s和 72℃ 30 s,扩增40个循环。使用2-△△CT法计算miR-19b-3p、PTEN mRNA 水平,以U6和β-actin为内参,引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 病情程度评估及分组 根据患者入院时的具体情况,综合总体退化量表(GDS)、日常生活能力量表(ADL)及临床痴呆评定量表(CDR)评估AD患者入院时的病情程度[10],轻度:患者记忆力受到影响,但生活能够自理;中度:较为严重的记忆障碍,部分患者伴随括约肌障碍,生活自理能力受到一定影响,需要他人的照顾;重度:智力损伤严重,出现明显的括约肌障碍,失去生活自理能力,完全依赖于他人的照顾。轻度AD患者纳入轻度组,中度及重度AD患者纳入中重度组。

2 结果

2.1 对照组与AD组血清miR-19b-3p、PTEN mRNA表达水平比较与对照组比较,AD组血清miR-19b-3p、PTEN mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 对照组与AD组血清miR-1p、PTEN mRNA表达水平比较

2.2 不同病情程度AD患者临床资料比较97例AD患者中轻度59例,中重度38例;两组AD患者的性别、年龄、病程、发病年龄、住院时间、文化程度、合并糖尿病、合并高血压、合并高脂血症、脑部疾病史、AD家族史、LDL-C、HDL-C、TG及TC水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);中重度组血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平均低于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 不同病情严重程度AD患者临床资料比较

2.3 影响AD病情严重程度的多因素分析将连续变量病程、血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平及脑部疾病史(有=1,无=0)作为自变量进行赋值,AD患者病情严重程度情况(中重度=1,轻度=0)作为因变量进行赋值,经Logistic回归分析表明,血清miR-19b-3p、PTEN mRNA低水平是影响AD病情严重程度的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4 影响AD患者病情严重程度的多因素分析

2.4 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平与AD严重程度的相关性分析经Spearman相关性分析表明,AD患者血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平与AD严重程度均呈负相关(r=-0.610,P<0.05;r=-0.870,P<0.05),见图1、2。

图1 血清miR-19b-3p水平与AD严重程度相关性的散点图

图2 血清PTEN mRNA水平与AD严重程度相关性的散点图

2.5 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平对AD病情严重程度的预测价值ROC分析结果表明,血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平及二者联合评估AD病情严重程度的AUC值(95%CI)分别为0.757(0.660～0.839)、0.718(0.617～0.804)、0.861(0.776～0.923),二者联合预测效能高于各项单独检测(Z=2.088、2.618,P<0.05),见表5、图3。

图3 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平单独及联合评估AD严重程度的ROC曲线图

表5 血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平对AD病情严重程度的预测价值

3 讨论

AD的病理位置为大脑皮层、海马区,病理区域的神经元纤维缠结、神经元损伤或丢失及老年斑的形成导致AD的发生[11]。β淀粉样蛋白(Amyloid-beta peptide,Aβ)具有一定的神经毒性,能够引起神经元的凋亡、淀粉样变及坏死,是老年斑的主要成分,当Aβ代谢异常导致Aβ聚集时,就会造成神经元损伤,引起AD的发生[12]。高度磷酸化的tau蛋白是神经元纤维缠结的重要构成成分,目前认为tau蛋白的过度磷酸化是AD发病机制中的重要环节[13]。因此Aβ与tau蛋白的过度磷酸化是目前AD领域的研究热点。

PTEN通过多种机制对大脑的发育及功能维持起到重要的调节作用,参与脑缺血等多种脑部疾病的发生与发展[14]。miR-19b-3p在血清中稳定存在,能够调控基因的表达,近年来研究发现,miR-19b-3p的表达与认知功能有关[15]。本研究对AD患者血清miR-19b-3p、PTEN表达情况进行检查,结果显示,AD组血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平均低于对照组,提示miR-19b-3p、PTEN参与AD的病情发展。中重度组血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平均低于轻度,经Logistic回归分析,血清miR-19b-3p、PTEN mRNA低水平是影响AD病情严重程度的独立危险因素,表明血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平影响AD的病情严重程度。分析原因为,PTEN在大脑中广泛表达,当认知功能出现障碍时,神经元受损,PTEN用于神经系统代偿性修复,导致外周血中PTEN mRNA水平降低。线粒体功能障碍是AD的一个显著特征,基础研究发现,线粒体功能在Aβ与tau蛋白的过度磷酸化中发挥重要作用[16]。miR-19b-3p能够调控Aβ与tau蛋白的表达,Aβ与tau蛋白表达减少引起神经元损伤,导致认知功能受损,AD病情进一步发展。PTEN是PI3K/Akt通路的主要负调控因子,Matsuda等[17]研究表明,PI3K/AKT/PTEN通路通过影响tau蛋白过度磷酸化及超氧化物歧化酶的表达,参与AD的发生与发展。PTEN过表达能够诱导推定激酶1,介导线粒体自噬,增加抗氧化蛋白的表达并减少氧化损伤,对神经元死亡发挥保护作用,逆转线粒体功能障碍,控制AD大鼠中线粒体的自噬作用[18]。江爱民等[19]研究证实,干扰LncRNA MCM3AP-AS1表达,能够通过靶向调控miR-19b-3p水平,减轻对氧糖剥夺再复氧诱导的神经元细胞损伤。上述研究与本研究均表明PTEN、miR-19b-3p参与AD病情发展。

Spearman相关性分析表明,AD患者血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平与AD严重程度均呈负相关,表明血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平随着AD病情严重程度降低。分析原因为,随着AD病情的发展,PTEN过量表达加重tau蛋白的过度磷酸化,通过线粒体凋亡促进神经元死亡,表现出以线粒体形态学异常及功能障碍为特征的氧化应激反应,从而引起认知功能异常,加重AD病情[20]。miR-19b-3p在AD病情发展中的作用机制目前尚不明确,有研究表明,miR-19b-3p通过靶向调控SH-SY1Y 细胞中的β-淀粉样前体蛋白水解酶5,缓解淀粉样蛋白β诱导的损伤,提示miR-19b-3p可作为AD治疗的保护剂[21]。推测miR-19b-3p减少Aβ能够引起神经元损伤,从而加重AD病情。此外PTEN为miR-19b-3p特意性靶标在细胞的分化调节中有重要作用,但在其是否可靶向调控PTEN影响神经元细胞仍有待进一步的实验验证[22]。临床可根据患者血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平判断患者病情程度,指导治疗方案的制定。为进一步分析血清miR-19b-3p、PTEN mRNA水平与AD病情严重程度的关系。本研究进行ROC分析,结果显示血清miR-19b-3p、PTEN mRNA联合预测的AUC值高于单独预测,提示二者联合能够提高血清miR-19b-3p、PTEN mRNA单独预测AD病情严重程度的灵敏度及特异度,表明二者联合对于预测AD病情严重程度具有更高的参考价值。临床可对血清miR-19b-3p表达水平低于0.48,且PTEN mRNA表水平低于0.31的患者予以重点检查,并及时干预,以延缓病情的发展,改善患者生活质量。

综上所述,AD患者miR-19b-3p、PTEN 水平异常降低,与AD病情严重程度呈负相关,miR-19b-3p联合PTEN mRNA检查对于预测AD病情严重程度具有较高价值。