非结核分枝杆菌感染者肝肾功能、免疫功能和耐药性分析

万鑫蕊，王晓燕，王 霖，马志强，李才信，许世涛，唐兴蕊，毛红艳

（昆明市第三人民医院检验科/云南省传染性疾病临床医学中心，云南 昆明 650301）

非结核分枝杆菌（non tuberculous mycobacterum，NTM）是指除麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群（tuberculosis，TB）以外的分枝杆菌，目前已超过170 种非结核分枝杆菌菌种被报道。NTM 在水、土壤等自然环境中广泛存在，可引起肺、皮肤、淋巴结和软组织等感染，其中NTM 肺病占90%以上[1]。随着免疫抑制人群的增多和细菌分离鉴定技术的提高，我国NTM 感染率呈逐年增加的趋势，已逐渐成为公共卫生健康问题。NTM 感染与结核病的临床表现、实验室和影像学检查十分相似，常常被误诊为肺结核。因此NTM 感染者大多接受了无效的抗结核治疗，引起了由抗结核药物导致的肝、肾功能损伤[2]。除此之外，目前研究表明机体免疫状态与NTM 感染和发展密切相关，尤其CD4+T 淋巴细胞在分枝杆菌感染的免疫控制中起重要作用[3]。为此分析我院非结核分枝杆菌感染者的肝肾功能、免疫功能和耐药性，以期为NTM 的临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2021 年5 月至2022 年3 月在昆明市第三人民医院确诊为非结核分枝杆菌感染的患者122 例为非结核组，其中男性55 例，女性67 例。并随机选取同期确诊为结核分枝杆菌感染的患者共130 例作为结核组，其中男性71 例，女性59 例。同时选取健康体检者150 例作为健康组，其中男性68 例，女性82 例。根据年龄段将2 组感染者分为青年（＜ 45 岁）、中年（45～60 岁）、老年（＞ 60 岁）3 组。本研究经过昆明市第三人民医院伦理委员会审查（KSLL20230320007）。非结核分枝杆菌感染者诊断标准[4]：符合下述条件之一可作出诊断（1）痰2 次NTM 培养均是同一致病菌；（2）痰或支气管肺泡灌洗液培养阳性++以上1 次；（3）痰或支气管肺泡灌洗液NTM 培养阳性1 次，涂片抗酸杆菌阳性++以上；（4）经支气管镜或其他肺组织检查，表明分枝杆菌组织病理学特征性（肉芽肿性炎或抗酸杆菌阳性），同时NTM 培养阳性；（5）肺组织活检发现分枝杆菌组织病理学特征（肉芽肿性炎或抗酸杆菌阳性）且至少1 个痰液或支气管肺泡灌洗液NTM 培养阳性1 次。结核分枝杆菌感染者诊断标准[5]：（1）2 个痰标本涂片抗酸染色直接显微镜镜检阳性；（2）1 份痰标本涂片抗酸染色直接显微镜镜检阳性，同时符合肺部影像学检查活动性肺结核影像；（3）1 份痰标本涂片抗酸染色直接显微镜镜检阳性，同时1 份痰标本结核菌培养阳性。排除标准：同时感染非结核和结核分枝杆菌的患者。

1.2 肝、肾功能检测

采用日立公司生产的008as 全自动生化分析仪检测结核组、非结核组和健康组的肝、肾功能指标包括总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBLI）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰氨基转移酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、肌酐（creatinine，CR）、尿素（carbamide，UREA）和尿酸（uric acid，UA）。

1.3 药敏实验

采用银科公司分枝杆菌药敏检测试剂盒进行微孔板药敏检测实验。吸取200 µL 杂菌抑制剂和200 µL 1mg/mL 的菌悬液加入到药敏培养集基中，混匀后吸取200 µL 加入到微孔药敏板中。放置于35 ℃ CO2培养箱中培养30 d 后观察结果。

结核分枝杆菌药敏包含异烟肼INH、利福平RFP、链霉素SM、乙胺丁醇EMB、左氧氟沙星LVFX、利福喷丁RFT、利福布丁RFB、丙硫乙酰胺PTO、力克肺疾DIP、对氨基水杨酸PAS、莫西沙星MFX、氯法齐明CFZ、卡那霉素KM、卷曲霉素CPM、克拉霉素CLR、阿米卡星AMK共16 种；非结核分枝杆菌药敏包含利福平RFP、乙胺丁醇EMB、阿米卡星AMK、莫西沙星MOX、克拉霉素CLR、利福喷丁RFT、米诺环素MNO、利奈唑胺LNZ、多西环素DOX、妥布霉素TOB、亚胺培南/西司IM/CI、加替沙星GAT、磺胺甲唑SMX、头孢西丁FOX、阿奇霉素AZM、和共15 种。

1.4 淋巴细胞亚群检测

使用迈瑞公司CD3/CD4/CD8/CD45 检测试剂对结核组、非结核组和健康组进行外周血T 淋巴细胞亚群计数。取CD3/CD4/CD8 检测试剂20 µL，加入EDTA 抗凝外周静脉血50 µL，涡旋混匀后室温避光放置15 min 后加入450 µL 溶血剂，涡旋混匀后室温避光放置15 min 后通过流式细胞仪检测各组 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞数量。

1.5 统计学处理

采用Excel 2013 建立数据库，SPSS 23.0 软件进行数据统计分析。正态分布的计量资料用（）表示，非正态分布的计量资料用M（P25，P75）表示。组间比较采用非参数秩和检验。计数资料用n（%）表示，组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料比较

非结核分枝杆菌感染者122 例，其中男性55 例、女 性67 例，年 龄15～87 岁，平 均（48.75±16.60）岁；结核分枝杆菌感染者130 例，其中男性71 例、女性59 例，年龄17～83 岁，平均（42±17.94）岁；健康对照组150 例，其中男性68 例、女 性82 例，年 龄16～85 岁，平 均（44±15.87）岁。非结核分枝杆菌感染者青年45 例、中年49 例、老年28 例；结核分枝杆菌感染者青年56 例、中年44 例、老年20 例；健康对照组青年79 例、中年45 例、老年26 例。3 组在不同年龄组和性别间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 非结核和结核分枝杆菌感染者年龄、性别比较[n（%）]Tab.1 Comparison of age and sex between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected people[n（%）]

2.2 肝肾功能指标比较

非结核组与结核组和健康组肝、肾功能指标比较，非结核组TBIL 9.0（6.9，12，6）、ALT 14（11，20）、AST 21（16，27）、GGT 23.6（16.9，41.1）、CR 63（53，73）、UA 375（300，478）与结核组和健康组相比均较高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。进一步分析非结核组和结核组2组间肝、肾功能指标差异，非结核组TBIL、ALT、AST、GGT 与结核组相比均较高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 非结核和结核分支杆菌感染者肝肾功能指标比较[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of liver and kidney function indexes between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients [M（P25，P75）]

2.3 外周血T 淋巴细胞亚群比较

非结核组和结核组的CD3+T、CD4+T、CD8+T与健康组相比均较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。非结核组CD8+T 淋巴细胞计数高于结核组，差异具有统计学意义（P＜0.05），CD3+T 和CD4+T与结核组相比差异无统计学意义（P＞ 0.05）。3 组间CD4/CD8 差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表4和图1。

图1 非结核和结核分支杆菌感染患者免疫功能比较Fig.1 Comparison of immune function between nontuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients.

表4 非结核和结核分支杆菌感染患者免疫功能比较（）Tab.4 Comparison of immune function between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（）

表4 非结核和结核分支杆菌感染患者免疫功能比较（）Tab.4 Comparison of immune function between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（）

3组间差异的显著性用非参数Kruskal-Wallis检验，*P＜0.05。3组间两两比较采用非参数Mann-Whitney检验，与健康组比较#P＜0.05；与结核比较，ΔP＜0.05。

2.4 耐药性情况比较

结核组对异烟肼的耐药率最高为22.31%，其次为利福平和利福喷丁分别为17.69%和16.15%。而对于丙硫乙酰胺、氯法齐明、卡那霉素、卷曲霉素、克拉霉素和阿米卡星均未有耐药菌株检出。在非结核组中，亚胺/西司的耐药率最高为99.18%，其次为多西环素和米诺环素，分别为78.69%和72.95%。非结核组对利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、克拉霉素和利福喷丁的耐药率均高于结核组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5、表6。

表5 非结核和结核分支杆菌感染患者耐药性比较（n）Tab.5 Comparison of drug resistance between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（n）

表6 非结核和结核分枝杆菌感染患者对同种抗结核药物耐药性比较n（%）Tab.6 Comparison of drug resistance with the same anti-tuberculosis drugs between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients n（%）

3 讨论

NTM 多发生于存在慢性基础肺部疾病和免疫功能缺陷的人群[6]。近年来NTM 感染导致的疾病发病率逐年上升，而NTM 感染和TB 感染临床症状相似，使之前部分诊断为肺结核的患者实际为NTM 感染。随着NTM 检测技术的发展，NTM 检出率也呈逐年上升的趋势，成为了值得研究的重要公共健康问题。

有研究表明，与青年相比中老年人感染NTM较为常见，可能与NTM 自身的生物学特性有关。NTM 是机会致病菌，与结核分枝杆菌相比毒力较弱，因此免疫力低下的中老年人更容易感染[7]。但在本研究中，非结核组和结核组相比年龄和性别没有显著差异。排除了后续对两组临床特征分析时年龄和性别带来的干扰。

目前使用的大部分抗结核药物对肝功能和肾功能均有一定的损害，并且多种抗结核药物联合用药与药物性肝损伤的发生密切相关[8-9]。异烟肼、利福平、乙胺丁醇等一线抗结核药物均会对患者的肝、肾功能产生影响，包括胆红素代谢异常、胆汁淤积以及肾脏代谢功能异常等[10]。本研究中与结核组和健康对照相比NTM 感染者肝肾功能指标均有不同程度的升高，而TB 感染者肝肾功能指标变化相对较少。NTM 感染组肝功能指标如TBIL、ALT、AST、GGT 均高于TB 感染组。提示NTM 组肝功能损伤更加严重，可能与非结核分枝杆菌感染易误诊为肺结核有关。非结核分枝杆菌感染后的临床症状和结核分枝杆菌相似，均有发热、咯血、咳嗽和咳痰等症状。并且NTM 感染也可使结核菌素实验、结核菌感染T 淋巴细胞斑点实验表现为阳性，因此NTM 感染易被误诊为结核分枝杆菌感染和结核病[11]，且大多NTM 感染者按照抗结核方案进行治疗，不仅治疗效果不佳而且容易导致耐药菌株的产生。长期抗结核药物的使用也使NTM 感染者与TB 感染者相比药物性肝损伤更加严重。

在复杂的宿主-病原体相互作用过程中，NTM 感染者的免疫功能受到抑制。固有免疫和适应性免疫在对抗NTM 感染均起到重要作用。NK细胞和巨噬细胞可以在感染早期阶段通过吞噬作用和颗粒酶消除和杀灭非结核分枝杆菌[12]。此外，CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞介导的细胞免疫促进各种细胞因子和趋化因子的产生，起到预防和控制NTM 感染作用[13]。本研究中，与健康对照组相比NTM 感染者和TB 感染者的CD3+T、CD4+T 和CD8+T 计数均有降低，提示2 组免疫功能均有一定损伤和降低，使感染者无法产生针对NTM 侵袭的细胞因子和抗体，最终促使NTM-PD 的发生。NTM 感染组CD8+T 淋巴细胞与结核分枝杆菌感染组相比显著升高，CD3+T、CD4+T 和CD4/CD8 相对较高但差异无统计学意义。CD4+T 释放的细胞因子如γ-干扰素、IL-12 等可激活巨噬和中性粒细胞杀灭NTM[14]，而CD8+T 淋巴细胞可以抑制体液和细胞免疫反应促使NTM 病情进展[15]。这种淋巴细胞亚群数量和比例的变化提示了NTM感染者免疫功能的紊乱和受损，也反映出细胞免疫的失衡可能增加了NTM 的易感性[16]。

分析NTM 感染者药敏结果发现，亚胺/西司、多西环素、米诺环素、乙胺丁醇和磺胺甲唑的耐药率均超过50%，但对阿米卡星和莫西沙星的耐药率较低，仅为4.1%。对于同种抗结核药物，如利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、克拉霉素和利福喷丁等，非结核分枝杆菌往往具有更高的耐药率。由于NTM 细胞壁的通透性屏障和表面的高疏水性[17]，NTM 对亚胺/西司、乙胺丁醇和磺胺甲唑基本处于天然耐药状态。除此之外，抗菌药物的长期使用、频繁更换也是耐药基因突变和耐药菌株大量繁殖的重要原因之一[18]。因此加强分枝杆菌的菌种鉴定，非结核分枝杆菌药敏试验的推广应用，对指导临床用药、减少耐药菌株的产生以及减轻患者痛苦和经济负担具有重要的意义。