青蒿素调控ENO2 介导的肾透明细胞癌细胞有氧糖酵解的机制

王英宝 ，李晓云 ，谭 莹 ，杨 萌 ，史云强 ，平秦榕 ，胡礼炳 ，杨 洋 ，王春晖

（1）昆明市延安医院泌尿外科，云南 昆明 650051;2）青岛市第八人民医院教育科，山东 青岛 266041;3）昆明医科大学第一附属医院麻醉科，云南 昆明 650032）

肾细胞癌是泌尿系统常见的原发性恶性肿瘤之一，占成人恶性肿瘤的2%～3%[1]。肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾细胞癌的主要亚型，每年约有9 万例患者死于ccRCC[2]。大多数患者在早期被确诊，但约30%的患者在初始诊断时即出现转移，晚期患者的5 a 生存率仅为32%。近来，诊疗技术的发展在延长了患者对的生存期，但肿瘤转移和化疗耐药仍是ccRCC 患者预后的主要限制因素。因此，探索新的治疗靶点和策略以抑制肿瘤的发展进程是ccRCC 治疗迫切需要解决的问题。

Warburg 效应是指在氧气充足的条件下，肿瘤细胞通过有氧糖酵解和减少线粒体氧化磷酸化来促进营养摄取和吸收，进而快速生长和增殖。有氧糖酵解是癌症发展的核心因素之一，其可满足癌细胞的能量需求，用于癌症生物质合成的糖酵解中间体，并营造微酸性环境[3]。因此。确定调节有氧糖酵解的调控机制至关重要。

青蒿素（Artemisinin）是一种含过氧基团的倍半萜内脂，主要来源于青蒿，是治疗恶性疟疾的一线药物。随着深入研究发现，青蒿素除了具有抗疟疾作用外，还具有抗肿瘤、抗炎等生物学作用[4]。然而，目前关于青蒿素对ccRCC 糖酵解的作用机制尚不清楚。烯醇化酶2（Enolase 2，ENO2）是烯醇化酶家族的重要成员，其催化磷酸烯醇式丙酮酸的合成以介导糖酵解和糖异生[5]。Chen等[6]报道，ENO2 在ccRCC 中表达升高。目前，关于ENO2 在ccRCC 中的作用机制尚不清楚。因此，本研究将探讨青蒿素调控ENO2 对ccRCC 糖酵解的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

人肾皮质近曲小管上皮细胞HK2 和ccRCC细胞系OSRC2 和ACHN 购自武汉普诺赛。si-NC和si-ENO2#1、si-ENO2#2、si-ENO2#3 由上海Genepharma 合成。CCK-8 试剂盒购自上海碧云天。葡萄糖测试盒和乳酸测试盒购自南京建成生物工程研究所。逆转录试剂盒购自日本Takara。一抗、二抗和ECL 化学发光液购自北京博奥森。

1.2 细胞培养

HK2 和ACHN 细胞分别在MEM 培养基内培养，培养基内含NEAA，10%胎牛血清和1%双抗。OSRC2 细胞在DMEM 培养基内培养，培养基内补充有10%胎牛血清和1%双抗，细胞培养基置于恒温细胞培养箱内培养，温度为37 ℃，含5% CO2。

1.3 细胞转染

根据试剂盒说明书，利用Lipofectamine 3000分别将si-NC 和si-ENO2#1、si-ENO2#2、si-ENO2#3 转染至OSRC2 和ACHN 细胞系中。在培养基内培养48 h，收集细胞检测转染效果。

1.4 CCK-8 检测细胞存活率

CCK-8 试剂盒用于评估细胞存活率。OSRC2和ACHN 细胞分别接种至96 孔板中，密度为6×103/孔，并将细胞暴露在0、10、20、30、40 µmol/L青蒿素环境中或转染si-NC 和si-ENO2。细胞置于培养箱内培养，在对应时间点加入20 µL CCK-8溶液与细胞共同孵育2 h。酶标仪检测450 nm 处的光密度值。

1.5 试剂盒检测葡萄糖消耗和乳酸生成

葡萄糖测试盒和乳酸测试盒用于测定细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成量。将各组细胞接种至96孔板中37 ℃孵育过夜。收集细胞，充分裂解后分别用于葡萄糖消耗和乳酸生成检测。

1.6 总RNA 提取和RT-qPCR 实验

使用TRIzol 试剂提取细胞中的总RNA，逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。以GAPDH 作为内参，cDNA 为模板，使用SYBR Green PCR 试剂盒进行RT-qPCR 反应，反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 50 s 进行45 个循环。2-ΔΔCt法用于计算目的基因的相对表达水平。

1.7 Western blot

细胞用RIPA 试剂裂解，10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质。然后转移至PVDF 膜上。在室温中用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后与稀释后的一抗（HK2：1∶500，LDHA：1∶500，GAPDH：1∶5 000，ENO2：1∶1 000）4 ℃过夜孵育。次日，漂洗PVDF 膜并与稀释后的二抗在室温中孵育2 h。TBST 漂洗，滴加ECL 化学发光液至膜上，凝胶成像仪显影。上述实验均进行3 次重复。Image J软件进行定量分析。

1.8 统计学处理

GraphPad Prism 8.0 软件用于分析数据和图片绘制，数据表示为平均数±标准差（x¯± SD）。2 组间数据比较采用学生t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用Tukey’s 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青蒿素抑制ccRCC 细胞存活和糖酵解

CCK-8 检测细胞存活率，见图1A 和图1B。随着青蒿素浓度的增加，细胞存活率降低，OSRC2 细胞的IC50为25.47 µmol/L，ACHN 细 胞的IC50为26.31 µmol/L，后续选择25 µmol/L 青蒿素处理细胞。随后，探索25 µmol/L 青蒿素处理细胞不同时间对OSRC2 和ACHN 细胞存活率的影响，见图1C 和图1D。青蒿素处理时间增加细胞存活率降低，且呈时间依赖性。试剂盒分别检测癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成水平，见图1E、图1F，结果发现25 µmol/L 青蒿素处理后细胞的葡萄糖消耗（P＜0.01）和乳酸生成量（均P＜0.05）低于NC 组。Western blot 结果表明，青蒿素处理组中HK2 和LDHA 表达低于NC 组，且差异有统计学意义（P＜0.01），见图1G-I。综上表明，青蒿素可抑制OSRC2 和ACHN 细胞存活率和糖酵解。

图1 青蒿素抑制ccRCC 细胞存活率和糖酵解Fig.1 Artemisinin repressed the survival rate and glycolysis of ccRCC cells

2.2 青蒿素下调ENO2 在癌细胞中的表达

ENO2 被报道通过激活和增强糖酵解促进肿瘤细胞的生长[7]。然而，目前关于ENO2 对ccRCC细胞糖酵解的作用尚不清楚。RT-qPCR 和Western blot 检测表明，OSRC2 和ACHN 细胞中ENO2 mRNA（图2A）和蛋白（图2B 和图2C）水平高于HK2细胞（P＜0.01）。经青蒿素处理的OSRC2 和ACHN细胞中，ENO2 mRNA（图2D，P＜0.05）和蛋白（图2E 和图2F，P＜0.001）水平明显低于NC 组。综上表明，青蒿素下调ENO2 在OSRC2 和ACHN细胞中的表达。

图2 青蒿素下调ENO2 在癌细胞中的表达Fig.2 Artemisinin inhibited the expression of ENO2 in ccRCC cells

2.3 青蒿素通过下调ENO2 抑制OSRC2 和ACHN 的存活率和糖酵解

随后，探讨青蒿素通过调控ENO2 的表达对ccRCC 细胞活力和糖酵解的作用。将si-NC 和si-ENO2 分别转染至OSRC2 和ACHN 细胞，转染si-ENO2#2 和si-ENO2#3 可降低ENO2 在癌细胞中的表达（P＜0.001），见图3A～3B。转染si-ENO2同时经青蒿素处理组中ENO2 的表达低于仅转染si-ENO2 组（P＜0.05），见图3C～3D。CCK-8 和试剂盒检测表明，敲降ENO2 可降低OSRC2 和ACHN 细胞存活率（图3E，P＜0.01）以及葡萄糖消耗量（图4A，P＜0.05）和乳酸产生（图4B，P＜0.05）。同时经青蒿素处理且敲降ENO2 组中细胞的存活率低于仅敲降ENO2 组（P＜0.001），葡萄糖消耗（P＜0.05）和乳酸生成（均P＜0.05）较敲降ENO2 组减少。Western blot 结果发现，敲降ENO2明显降低HK2 和LDHA 在OSRC2 和ACHN 细 胞中的表达（P＜0.05），见图4C～4E，经青蒿素处理进一步下调细胞中HK2 和LDHA 的表达（均P＜0.05）。综上表明，青蒿素通过下调ENO2 在OSRC2 和ACHN 细胞中的表达，降低癌细胞的活力和糖酵解。

图3 青蒿素通过下调ENO2 抑制癌细胞活力Fig.3 Artemisinin repressed cancer cell viability by downregulating ENO2 expression

图4 青蒿素通过下调ENO2 抑制癌细胞糖酵解Fig.4 Artemisinin repressed cancer cell glycolysis by downregulating ENO2 expression

3 讨论

ccRCC 具有较高的发病率和死亡率，是最致命的泌尿系统恶性肿瘤之一。然而，即使患者即使接受了手术切除和放疗，仍有30%的患者发展为转移期[8]。了解ccRCC 的病理机制和探索新的治疗策略十分重要。本研究发现，青蒿素可通过调控ENO2 抑制OSRC2 和ACHN 细胞的存活率并抑制癌细胞的糖酵解过程，表明青蒿素具有良好的抗癌功能。

青蒿素的抗肿瘤作用是近来研究的热点，不仅可以单独作用于肿瘤细胞，还可与其他药物联合使用。在食管癌细胞中，青蒿素通过靶向抑制HIF-1α 抑制癌细胞的增殖、转移和糖酵解，抑制食管癌的发展[9]。青蒿素通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活，进而诱导葡萄膜黑色素瘤细胞线粒体膜电位丧失，抑制癌细胞的迁移和侵袭[10]。青蒿素衍生物双氢青蒿素激活抗存活未折叠蛋白反应并上调CHAC1 的表达，诱导原代肝细胞的铁死亡[11]。双氢青蒿素可提高ROS 水平和损害血红素代谢，降低EGFR 突变型非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药性[12]。笔者的研究发现，青蒿素可降低ccRCC 细胞系的存活率并抑制细胞的糖酵解，抑制ccRCC 的进程。此外，Yu 等[13]报道青蒿素和AKT 抑制剂的联合使用可增强对ccRCC 细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。

糖酵解是肿瘤细胞发育过程中常见的代谢途径，增殖细胞中的糖酵解活性增加，抑制糖酵解可抑制癌细胞的发展进程。敲降circME1 通过下调ME1 的表达，抑制ccRCC 的有氧糖酵解[14]。PGK1 通过激活CXCR4/ERK 信号通路并加速糖酵解，促进ccRCC 的肿瘤发生和索拉非尼耐药性[15]。PFKFB3 敲降抑制肾细胞癌细胞的糖酵解、增殖率和细胞周期G1/S 期转化[16]。Trim21 通过泛素化介导的HIF-1α 降解抑制肾细胞癌细胞的糖酵解，并抑制肾细胞癌细胞体外和体内的增殖、肿瘤发生和转移[17]。笔者的研究发现，青蒿素或敲降ENO2 可抑制OSRC2 和ACHN 细胞的活力及糖酵解过程。

ENO2 是糖酵解中的一种限速酶，促进2-磷酸甘油酸酯转化为磷酸烯醇丙酮酸。同时，研究发现，ENO2 也是包括头颈鳞状细胞癌[18]、肺癌[19]、乳腺癌[20]等肿瘤的成熟生物标志物，促进肿瘤的发生与发展。例如：ENO2 过表达促进乳腺癌细胞的增殖和迁移[7]；敲降ENO2 可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解[21]；上调ENO2 的表达促进鼻咽癌细胞的放疗抵抗[22]；ENO2 可促进急性淋巴细胞白血病细胞的增殖、糖酵解和糖皮质激素抵抗[23]。Pan 等[24]报道，ENO2 高水平的患者在肿瘤微环境中可能有较高的M2 巨噬细胞和较低的 γβT细胞，可能与ccRCC 患者预后较差有关。ENO2 可促进ccRCC细胞的增殖、侵袭和迁移[6]。笔者的研究发现，ENO2 在ccRCC 细胞系OSRC2 和ACHN 细胞中表达升高，青蒿素可下调ENO2 在癌细胞中的表达，敲降ENO2 降低OSRC2 和ACHN 细胞活力和糖酵解。

综上所述，研究发现，青蒿素通过下调ENO2在OSRC2 和ACHN 细胞中的表达，降低癌细胞的存活率并抑制糖酵解过程，进而抑制ccRCC 的发展。