外源生殖激素对小鼠超数排卵及胚胎发育的影响

王巨龙,张继辉,黎婷,张海燕,刘宽辉,许泽军

(芜湖职业技术学院 食品与生物工程学院,安徽 芜湖 241003)

人工辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)是利用现代辅助医学生殖技术手段在体外将精子与卵子结合,使不孕不育夫妇完成妊娠的技术[1].其中涉及超数排卵技术、体外人工受精术或显微单精注射术、体外胚胎体外发育及胚胎移植等相关技术.1977年,爱德华兹首次通过体外人工受精及胚胎移植技术应用于人类生殖.该技术成功让一对不育夫妇诞下一名健康的胎儿[2].近年来,随着ART技术不断完善发展,早期胚胎发育率及胚胎质量得到很大提高,但早期胚胎发育仍是模拟体内发育环境,势必影响胚胎质量,导致受精卵着床率低.为了获取更优质的胚胎,往往采用超数排卵技术获得较多成熟的卵子进行体外受精.该技术通过外源性生殖激素注射雌性动物,促使卵巢发育更多的卵泡并促使成熟卵子排出.超数排卵技术能较好地募集卵泡,获取多的卵母细胞,利用辅助生殖技术,大大增加妊娠的机会,但在非自然的激素诱导下可能影响卵母细胞和胚胎发育的质量[3].已有的研究显示,通过外源激素超数排卵获取小鼠早期胚胎,在8 cell阶段全基因组CpG甲基化水平显著降低[4].与此同时,超数排卵技术对父系印记基因H19及母系印记基因小核核糖核蛋白肽N (small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N,Snrpn),父系表达3 (paternally expressed 3,Peg3) DNA甲基化水平呈剂量依赖性改变[ 5 ].超数排卵引起表观遗传DNA甲基化水平波动,可能直接或间接影响胚胎发育关键基因的表达.一项针对 ART 后出生的儿童的研究表明,DNA 甲基化的变化与多个基因的转录变化相关[6].本实验使用小鼠作为模型动物,利用外源生殖激素孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)研究超数排卵对小鼠胚胎质量及胚胎发育相关基因表达影响.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验使用6-8周龄雌性、12周龄雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)昆明白小鼠.小鼠饲养环境湿度保持50%～65%.光照时间为8∶00 ～20∶00,饲养温度在20～25 ℃,自由采食、饮水.

1.1.1 实验设备及药品

CO2培养箱(德国Hera cell)、荧光定量PCR仪、荧光倒置显微镜(日本Nikon)、体视显微镜、HTF精子获能液(Sigma)、胚胎培养液(KSOM+AA)、M2培养液(Sigma)、RNA微量试剂盒(QIAGEN )、微量反转录试剂盒(Thermo)、透明质酸酶(Sigma)、石蜡油(Sigma)、35 mm培养皿(Sigma)、胎牛血清FBS(Gibco)、PMSG(宁波三生)、HCG(宁波三生)、DAPI染液及抗荧光淬灭封片液(碧云天)、生理盐水.

1.2 实验方法

1.2.1 超数排卵及卵子获取

选取6-8周龄的雌性昆明白小鼠,腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG),12 h后颈椎脱臼法将雌鼠处死,腹腔消毒,手术剪刀打开腹腔,沿着输卵管找到输卵管壶腹部,用剪刀将输卵管及壶腹部剪掉,放入盛有生理盐水培养皿中,在体视显微镜下,用尖头镊子将输卵管壶腹部刺破,卵丘卵母细胞复合体(COCs)流出.用捡卵针将COCs收集于M2培养液中.

1.2.2 成熟卵母细胞体外受精及胚胎培养

选择12周龄以上的SPF级雄性昆明小鼠.取精前一周公鼠单独饲养,采用颈部脱臼处死,腹部喷洒酒精消毒,用剪刀剖开腹部找到睾丸位置.用剪刀取出附睾尾部及输精管,并将输精管及附睾尾剪成数段,用镊子轻轻挤压输精管使精子挤入1000 μL过夜平衡的HTF中,放入37 ℃,5% CO2培养箱中精子获能 1.5～2.0 h.

将上述方法收集COCs,并将其转移到100 μL HTF小滴中.获能的精子浓度为1.5×106～2×106个/mL.孵育6 h后,将这些卵母细胞转移到胚胎培养液(KSOM+AA)中,用石蜡油覆盖,置于37 ℃,5% CO2培养箱中进行培养120 h,获取囊胚.

1.2.3 体内胚胎的收集

按上述1.2.1方法外源激素处理后,与公鼠1∶1合笼自然交配.交配的雌性小鼠于次日可观察阴道栓,单笼饲养5 d后,颈部脱臼处死,获取输卵管、子宫,收集囊胚期胚胎.

1.2.4 囊胚细胞计数

将体外受精获取的囊胚和超数排卵后体内囊胚收集,并用Hoechst 33342染色10 min.然后压片后,使用Fluoview 1000激光扫描共聚焦显微镜使用20倍物镜获得图像.

1.2.5 RT-PCR胚胎相关基因的表达

采用RT-PCR检测胚胎发育相关基因mRNA表达水平,引物设计如下表,内参基因为β-actin,引物由擎科创新生物公司合成.将实验获取的囊胚,按照QIAGEN公司的RNA微量试剂盒(QIAGEN RNeasy Plus Micro Kit)说明提取总RNA,取2 μL检测总RNA的浓度,要求RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之间,接着使用反转录合成第一条cDNA链试剂盒(Thermo)反转录成cDNA.RT-PCR反应体系如下:cDNA 1 μL、Forward Primer 0.5 μL、Reverse Primer 0.5 μL、SYBR Mix 5 μL、ddH2O 3 μL,总体系为10 μL.反应条件为:预变性 95 ℃,5 min.PCR为95 ℃,15 s、60 ℃,30 s、72 ℃,45 s,共44个循环.

1.3 实验设计

1.3.1 实验设计一:不同剂量PMSG和HCG对小鼠超数排卵的影响

将雌性小鼠随机分为6组,每组注射相同剂量的PMSG和HCG.注射剂量分别为1 IU、5 IU、10 IU、15 IU、20 IU,对照组注射生理盐水.颈椎脱臼法将雌鼠处死,按照1.2.1方法统计卵母细胞成熟率,成熟的卵母细胞以第一极体排出为标志.

1.3.2 实验设计二:外源生殖激素作用下对体内胚胎和体外胚胎发育的影响

将雌性小鼠随机分为3组,记作A、B、C组.根据实验设计一,确定最优剂量组.A组为雌性小鼠注射生理盐水后,与公鼠1∶1合笼自然交配.B组为雌性小鼠注射最优剂量组,与公鼠1∶1合笼自然交配.C组为雌性注射最优剂量组,获取成熟卵母细胞体外受精,进行体外胚胎发育.A、B组120 h后颈椎脱臼法将雌鼠处死,收集囊胚,统计胚胎数目并对胚胎发育相关基因检测.

1.4 数据统计与分析

实验统计成熟卵母细胞以明显第一极体排出为标志,成熟率=成熟卵母细胞数/卵母细胞总数×100%.实验数据通过SPSS 19.0软件进行LSD多重比较进行显著性分析.实验组至少有3次独立重复实验数据,以平均值±标准差表示,*表示p<0.05差异显著,**表示p<0.01差异极显著.

2 结果与分析

2.1 外源生殖激素对小鼠超数排卵的影响

由表1显示,10 IU PMSG+10IU HCG剂量组、15 IU PMSG+15 IU HCG剂量组、20 IU PMSG+20 IU HCG剂量组平均获得卵子总数为110枚、112枚、103枚,差异不显著(p>0.05).但显著高于(1+1)IU和(5+5)IU剂量组.其中10 IU PMSG和10 IU HCG处理获得110枚卵母细胞,卵细胞成熟率与(1+1)IU、(5+5)IU和(15+15)IU剂量组相比差异显著(p<0.05).由此可见,10 IU PMSG+10 IU HCG剂量组获得卵母细胞质量要优于其他组合.

表1 不同浓度外源生殖激素对小鼠超数排卵的影响

2.2 外源生殖激素对体内外受精胚发育的影响

为进一步探究外源生殖激素PMSG和HCG对小鼠体内外受精胚的影响,处理如表2所示.实验结果显示,B组雌性小鼠注射10 IU PMSG和10 IU HCG后,与公鼠1∶1合笼自然交配获得囊胚数与A组、C组相比差异显著(p<0.05);A组与C组间胚胎细胞数差异极显著(p<0.01).由上可知,在用外源生殖激素10 IU PMSG和10 IU HCG处理后自然交配获得胚胎质量最好.

表2 外源生殖激素对体内外受精胚发育的影响

2.3 胚胎发育相关基因mRNA水平表达

对多能性基因检测由图1显示,A组囊胚期胚胎,Pou5f1 mRNA水平显著高于生殖激素处理交配B组与生殖激素处理体外人工受精C组(p<0.05),其中A、C组差异极显著(p<0.01).B组与C组相比较,Sox2 mRNA表达水平上调,且差异显著(p<0.05).

注:*表示差异显著p<0.05,**表示差异极显著p<0.01

3 讨 论

生殖激素PMSG 和HCG在牛[7]、猪[8]、羊[9]开展较多的研究和应用,现广泛用于动物繁殖生产.随着技术的改进,人工辅助生殖技术已应用于人类生殖健康.超数排卵作为ART关键技术,受到许多因素的影响.在临床上主要与种属生理状态、年龄、激素的种类及剂量相关.有研究表明,激素剂量的大小,对卵母细胞的成熟有关,低剂量对卵巢刺激度小,卵泡发育低[10];高剂量往往会对卵巢过度刺激,可能会造成卵母细胞减数分裂期纺锤体组装异常、卵子发育不正常甚至停止发育.Tain等人研究发现,促排卵激素会过度刺激卵巢,造成卵母细胞发育异常率增加[11].周晓旭等研究显示高剂量使用PMSG和HCG,小鼠的妊娠率及产仔数显著下降[12].这些表明一定激素剂量与卵子质量及胚胎质量呈相关性.

我们利用不同浓度PMSG 和HCG处理小鼠,发现15-20 IU高剂量处理小鼠获取卵子数量及成熟率显著下降.低剂量组下,获得卵子总数较少.这也印证低剂量激素促使卵巢卵泡发育能力有限.

调控胚胎发育相关基因能否正常表达,关乎早期胚胎质量及胚胎附植子宫.其中Sox2、Pou5f1便是调控其发育的关键基因.Pou5f1又称Oct4,是POU转录因子家族重要的一员.研究发现哺乳动物早期胚胎2 cell时期Oct4 mRNA表达水平高于囊胚期,Oct4正常表达可能是受精卵能否卵裂的关键[13].早期胚胎时期Sox2 mRNA在小鼠各阶段表达各不同,囊胚期Sox2 mRNA维持高表达水平.

总之,本次利用外源激素对小鼠超数排卵及胚胎发育及相关研究发现:低剂量和高剂量的激素无法获取适当量的优质卵子.激素处理下小鼠体内早期胚胎Pou5f1、Sox2 mRNA表达处于高水平状态,胚胎质量较高.后期我们仍需要进一步探究外源性生殖激素对胚胎发育重要基因调控以及它对后续胚胎全期发育的影响.