苯并［a］芘恶性转化细胞THBEc1致裸小鼠原位肺癌模型的构建及血清人源神经纤维网蛋白2对该模型的诊断价值

邢云昆，马雪，姚碧云，付娟玲，赵鹏，祁妍敏

（1.北京大学公共卫生学院毒理学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191；2.中国民用航空局民用航空医学中心，北京 100123）

2022年2 月，国家癌症中心发布的最新一期全国癌症统计数据显示，在我国，肺癌的发病率和死亡率均居首位［1］。肺癌的早发现、早诊断和早治疗均依赖于肺癌发生机制的阐明。深入探索肺癌的发病机制，筛选潜在的诊断和治疗靶点，以及研发新型化疗药物都需要以合适的肺癌动物模型为基础［2］。合适的肺癌动物模型要具备建模方法简单、可重复、最大程度模拟肺癌微环境及在体环境的特点。目前用于肿瘤研究的动物模型主要有人源异种移植模型、细胞肿瘤模型和遗传工程小鼠模型，前两者按成瘤部位又可分为异位肿瘤模型（包括皮下及腹腔）和原位肿瘤模型等［3-5］。最常用的是皮下移植瘤模型（尤其是腋下），此方法操作简便，成瘤率高，易于监测肿瘤生长。但由于皮下肿瘤在微环境、局部浸润和远处转移模式等方面与原位肺癌存在较大差异，使得皮下移植瘤模型不能很好地模拟临床肺癌发生发展的全过程及伴随的胸水产生等并发症。原位肿瘤模型能够反映肿瘤的生物学特性，更能够模拟肿瘤在人体内的生长和转移过程，在肿瘤机制研究、标志物筛选和药物评估等方面应用较多，因而是当前较为理想的动物模型［6-7］。但原位肿瘤模型成瘤率较低，不易直接动态观察，需要借助超声或手术等方式观察肿瘤生长状况，限制了其应用和发展［8］。在研究化学致癌物所致肺癌时，常采用诱发肿瘤的方法制备原位肿瘤模型，但该模型制备困难，且存在诱发肿瘤时间长、成瘤率不理想、重现性差等缺陷［9-11］。考虑到微环境对肿瘤生长的影响，原位肺癌模型能够基本模拟肺癌在体内的发生发展过程，也能够反映发生胸水和远处转移的实际临床现象。

目前，建立原位肺癌模型的方法主要有致癌物诱发、基因工程小鼠、经支气管注射细胞悬液、经胸壁注射细胞悬液、尾静脉注射细胞悬液和肿瘤组织移植等，相较于膀胱、结肠、肝等其他原位肿瘤模型，原位肺癌动物模型的发展较慢［12-14］。建立操作简便、成瘤快、可重复、易鉴定的原位肺癌模型将为探究肺癌发病机制、筛选相关生物标志物，以及抗肿瘤药物的非临床药效学和安全性评价提供较理想的模型。苯并［a］芘恶性转化人支气管上皮细胞T-16HBE-C1（THBEc1）由本课题组构建并保存，THBEc1 细胞接触抑制特性消失，在裸小鼠皮下可快速生长成肿瘤，呈高迁移和侵袭表型，病理呈鳞癌特征，且裸小鼠血清人源神经纤维网蛋白2（neuropilin-2，NRP2）水平能很好反映皮下肿瘤的生长［15-17］。因此，本研究选择THBEc1，通过肺内注射直接将癌细胞接种于裸小鼠肺内建立原位肺鳞癌裸小鼠模型，以期为肺癌特别是化学物所致肺癌相关研究提供选择。同时评估NRP2在THBEc1致裸小鼠原位肺癌诊断中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

MEM 培养液，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Corning 公司；青霉素、链霉素和胰蛋白酶，美国Sigma 公司；人NRP2 酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，北京义翘神州科技股份有限公司；牛血清白蛋白，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；单组分3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）显色液，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、硫酸、甲醛和无水乙醇等试剂，北京化工厂；96孔酶标板，美国Corning公司；SCI-165D CO2恒温培养箱，日本ASTEC公司；FLUOstar Omega酶标仪，德国BMG LABTECH 公司。

1.2 细胞培养

人支气管上皮细胞16HBE（HBE）由中山大学陈雯教授惠赠，本实验室保存。HBE 细胞在裸小鼠体内无致瘤性。BaP 恶性转化细胞THBEc1 由本实验室建立，可在裸小鼠体内成瘤［15-16］。2 种细胞均使用含10%（V/V）灭活胎牛血清的MEM 培养液培养于37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱中。当细胞80%～90%融合时，使用磷酸盐缓冲液清洗细胞2 次，于25 cm2培养瓶中加入2.5 g·L-1胰蛋白酶/0.2 g·L-1EDTA-Na2消化液1 mL，37 ℃培养箱中消化7 min，使用MEM 完全培养液终止消化并吹打成单细胞悬液，按1∶4比例进行传代培养。

1.3 动物和实验分组

SPF 级ICR 小鼠12 只，BALB/c-nu 裸小鼠16 只，均为4 周龄雄性，购自北京大学医学部实验动物科学部，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0013。实验动物饲养于SPF级动物房IVC笼具内，温度24 ℃，12 h 昼夜交替，自由饮水和进食。所有涉及动物使用和福利的实验方案均在实施前经北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准，批准编号：LA2020237。

ICR 小鼠用于确定肺内注射的安全注射体积。根据体重随机分为3 组，各组小鼠分别肺内注射无菌生理盐水20，30和40 μL。

BALB/c-nu裸小鼠用于原位肺癌和皮下荷瘤建模。根据体重随机分为4 组，即对照组（皮下+肺内同时接种HBE 细胞，皮下1×106，肺内2×105）、皮下荷癌模型组（皮下一次性接种THBEc1 细胞1×106）和原位肺癌模型组（肺内一次性接种THBEc1 细胞2×105或5×105）。

1.4 肺内注射位置及安全注射体积的确定

为避免穿刺时对心脏的损伤，本研究选择右肺作为接种肿瘤细胞的部位。同时，根据小鼠肺解剖位置，选择第5 或第6 肋间与胸骨旁线交点作为穿刺点。使用30G 针头于穿刺点垂直小鼠皮肤进针，进针深度约4 mm，继而将无菌受试物注射入小鼠右肺内，停留片刻后退针。各组ICR 小鼠分别肺内一次性注射无菌生理盐水20，30 和40 μL，观察注射后小鼠状态及14 d内死亡数量。

1.5 裸小鼠原位肺癌模型和皮下荷瘤模型的建立及鉴定

本课题组前期研究发现，BaP 恶性转化细胞THBEc1 能在BALB/c-nu 裸小鼠皮下成瘤，最小成瘤细胞量为8.0×104［16］。根据1.3 分组并处理BALB/c-nu 裸小鼠，原位肺癌模型组细胞接种于裸小鼠右肺，对照组皮下和肺内2 个部位分别接种细胞，皮下荷瘤模型组细胞接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，于接种细胞后每7 d 测小鼠体重和皮下肿瘤的长径和短径，根据公式V=0.5×W2×L（W为肿瘤短径，L为肿瘤长径）计算肿瘤体积。原位肺癌模型5×105细胞组在接种细胞后第10 天因小鼠出现呼吸困难、濒临死亡，提前结束实验，其余3 组均于第14 天结束实验。实验结束后，乙醚麻醉小鼠，经球后静脉丛采血分离血清，原位肺癌模型5×105细胞量组同时采集、血清和胸水，分装后均-80 ℃保存。继而对小鼠进行安乐死，剖取肺及皮下荷瘤模型组小鼠皮下肿瘤，经4%甲醛固定后HE染色进行组织病理学检查。

1.6 ELlSA测定裸小鼠血清中人源NRP2水平

取1.5 分离制备的裸小鼠血清样品，根据人NRP2 ELISA 试剂盒说明书检测血清及原位肺癌模型5×105细胞组胸水中人源NRP2 水平。采用双波长法测定吸光度（A）值，检测波长450 nm，参比波长630 nm。将A450nm和A630nm差值作为纵坐标，浓度作为横坐标，绘制标准曲线并计算样品中人源NRP2浓度。

1.7 统计学分析

实验结果数据以±s表示。采用SPSS 27.0软件进行统计学分析。多重比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）Fisher 最小显著性差异（least significant difference，LSD）法检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线确定血清人源NRP2 对THBEc1 细胞致裸小鼠原位肺癌模型的诊断价值。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺内注射无菌生理盐水的安全注射体积

注射无菌生理盐水后14 d 内，肺内注射40 μL组小鼠死亡2/4，死亡发生在注射后24 h 内；20 和30 μL组小鼠死亡均0/4，但30 μL组小鼠注射后呼吸急促、精神萎靡、活动减少，而20 μL组小鼠进食和饮水等活动未见明显异常，故后续实验注射体积选择20 μL。

2.2 THBEc1细胞致原位肺癌模型和皮下荷瘤模型裸小鼠体重和肺癌病理变化

体重变化如图1 所示。在实验期内，正常对照组小鼠体重持续增长；皮下荷瘤模型组和原位肺癌模型5×105细胞组小鼠在接种细胞7 d后均出现体重下降，到14 d 实验结束时体重均明显低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）；原位肺癌模型2×105细胞组小鼠在接种细胞7 d 后体重增加缓慢，但在实验结束时（10 d）体重仍然低于正常对照组（P＜0.05）。

Fig.1 Changes in body weight of nude mice after THBEc1 cell inoculation.Sixteen male BALB/c-nu nude mice were randomly divided into 4 groups：the control group [subcutaneously and intrapulmonary inoculated with human bronchial epithelial 16HBE（HBE）cells 1×106 and 2×105 per mouse，repectively]，the subcutaneous tumor group（SCT，subcutaneously inoculated with THBEc1 cells 1×106 per mouse）and the orthotopic lung tumor group（OLT，intrapulmonary inoculation with THBEc1 cells 2×105 or 5×105 per mouse）.The experiment in the OLT group ended on the 10th day after cell inoculation，other groups on the 14th day.Body weight was measured every 7 d.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group at the same time point.

皮下荷瘤模型组祼鼠第7 天可触及皮下肿瘤，4 只小鼠均成瘤；第14 天肿瘤体积达（211±69）mm3（图2），小鼠活动受限，实验结束。组织病理学检查结果如图3所示，肿瘤呈鳞状细胞癌特征，即肿瘤细胞呈巢式生长，胞核深染，核质比高，分化程度较低，存在粗大团块样染色体、不典型核分裂和周围肌肉组织浸润，肿瘤中部可见大片坏死区。正常对照组于接种细胞后第7天和第14天均未检出肿瘤。

Fig.2 Subcutaneous tumors（A）and their volume（B）of nude mice after being subcutaneously inoculated with THBEc1 cells.See Fig.2 for mouse treatment.±s，n=4.

Fig.3 Histopathological features of tumors of nude mice after being subcutaneously inoculated with THBEc1 cells by HE staining.See Fig.1 for mouse treatment.The arrows point to the tumor's squamous cell carcinoma features.

对照组全部4 只小鼠，大体解剖及组织病理学检查均未在肺内检出肿瘤（图4A～D，A1～D1）。

接种细胞后第14 天，原位肺癌模型2×105细胞组小鼠活动如常，解剖可见3 只小鼠右肺存在白色病灶（图4E，G，H）。肺内接种细胞后第10 天，原位肺癌模型5×105细胞组动物活动减少，呼吸困难，个别小鼠处于濒死状态，故提前结束实验；解剖可见4 只小鼠右肺均存在白色病灶（图4I～L），且心脏与横膈间可见较大肿瘤灶（图4I～K），胸腔可见血性积液。组织病理学检查显示，上述2组7只小鼠肺的白色病灶均为鳞状细胞癌（图4E1，G1，H1，I1～L1），病理特征与THBEc1 细胞引起的上述皮下肿瘤一致，且可见较大肿瘤侵犯气管和支气管，余1 只小鼠大体及组织病理学检查均未检出肿瘤（图4F，F1）。结合大体解剖和组织病理学检查，原位肺癌模型5×105细胞和2×105组成瘤分别为4/4和3/4。

Fig.4 Lung photographs（A～L）and histopathological features（A1～L1）of tumors of nude mice after intrapulmonary injection of THBEc1 cells by HE staining.See Fig.1 for mouse treatment.The arrows show the tumors growing between the heart and diaphragm.

综上所述，皮下接种1×106和肺内接种5×105细胞时，THBEc1 细胞在裸小鼠皮下和肺内的成瘤均为4/4，肺内接种2×105细胞成瘤为3/4，而HBE细胞在裸小鼠皮下和肺内均无致瘤性。表明通过肺内注射THBEc1细胞可以建立裸小鼠原位肺癌模型。

2.3 血清人源NRP2在THBEc1细胞致裸小鼠原位肺癌模型中的诊断价值

各组裸小鼠血清及胸水中人源NRP2 水平如图5A 所示。皮下荷瘤模型组裸小鼠血清及原位肺癌模型5×105细胞组裸小鼠胸水和血清中人源NRP2 水平均高于对照组（P＜0.01）。原位肺癌模型2×105细胞组裸小鼠血清人源NRP2 水平与对照组比较无明显变化。如果仅对该组原位肺癌建模成功的3 只小鼠与对照组小鼠的血清人源NRP2 水平进行比较，则差异具有统计学意义（P=0.0182）。

取全部16 只裸小鼠的数据绘制血清人源NRP2 水平诊断THBEc1 细胞致裸小鼠原位肺癌的ROC 曲线，结果如图5B 所示。该曲线AUC 值为1.000（95%可信限为1.000～1.000，P=0.0018），最佳截断值为123.00 pg·mL-1，提示血清人源NRP2水平能较好地区分THBEc1 细胞在裸小鼠肺内是否成瘤，即对THBEc1 细胞所致裸小鼠原位肺癌模型具有潜在的判断价值。

Fig.5 Human-derived NRP2 levels in nude mice serum and pleural fluid by Kit（A）and its receiver operating characteristic（ROC）curve（B）.See Fig.1 for mouse treatment.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with control group.

3 讨论

本研究采用肺内注射方式接种BaP 恶性转化细胞THBEc1 于裸小鼠右肺内，接种细胞后可在较短时间建模，是一种操作简便、成瘤快、易鉴定的原位肺癌模型制备方法。且通过测定血清人源NRP2水平即可鉴定原位肺癌模型是否建模成功。本课题组前期研究显示，接种1.2×105细胞时，THBEc1在裸小鼠皮下成瘤4/4［16］，本研究中，肺内接种THBEc1 细胞2.0×105时，约为皮下接种细胞量的2 倍，但肺内成瘤为3/4，低于皮下。这种差异一方面提示组织环境（如肺内的相对富氧环境和皮下的相对缺氧环境等）可能影响肿瘤细胞的成瘤能力，另一方面反映了原位肺癌模型和皮下移植瘤模型中肿瘤发生发展过程的差异。因此，裸小鼠原位肺癌模型可能较皮下荷瘤模型能够更好模拟人肺癌的发生发展过程。在本研究建立的THBEc1 致裸小鼠原位肺癌模型中，接种2.0×105细胞时成瘤为3/4，接种5.0×105时成瘤为4/4。增加接种细胞量能进一步提高成瘤率，但会影响荷瘤裸小鼠的生存时长。参考周永春等［18］、杨晓华等［19］和March等［20］所构建的肺原位肿瘤模型，使用基质胶作为介质，或在接种肿瘤细胞前使用X线照射等方式以抑制裸小鼠免疫功能且轻微破坏肺上皮或肺表面，均可在不增加细胞接种量的前提下提高成瘤率，有助于延长饲养时间，进行肺癌发展及转移或药物疗效等的相关研究。同时，相比于经支气管注射细胞悬液、经尾静脉注射细胞悬液和肿瘤组织移植等构建肺原位肿瘤模型的方法，本研究所采用的经胸壁直接肺内注射细胞悬液法，具有操作简便、快捷、技术难度低、成瘤快、成瘤率高、对动物的损伤小、安全性较高等优点。THBEc1 细胞是经BaP 恶性转化的细胞，其接触抑制特性消失，具有可复层生长、非锚定依赖生长等肿瘤细胞特征，且该细胞在裸小鼠体内所致肿瘤为典型鳞状细胞癌，成瘤快，特性稳定，在肺肿瘤尤其是化学物所致肺肿瘤的相关研究中具有一定的代表性。

动物原位肺癌模型的应用和发展之所以受到限制，主要原因之一是无法动态观察肿瘤生长状况，需要借助小动物CT、核磁、活体成像系统或手术进行观察，增加了操作难度和建模成本，难以普及［21-22］。这种情况下，外周血生物标志物的检测可能是更好的选择。血清肿瘤标志物不仅有助于肿瘤的筛检和鉴别诊断，而且可用于预后和疗效评估［23］。目前在临床上应用及研究最多的肺癌血清生物标志物主要有癌胚抗原、细胞角蛋白19 片段、神经元特异性烯醇化酶和鳞状细胞癌抗原等［24］。找到合适的血清生物标志物应用于监测肺癌的生长将有利于动物原位肺癌模型的进一步发展。许多体内和体外研究发现，NRP2 与肺癌、骨肉瘤、前列腺癌等多种肿瘤的血管生成、肿瘤细胞生长及转移有关，降低NRP2的表达可抑制肿瘤的侵袭表型，因此其被认为是侵袭性肿瘤表型的候选生物标志物［25-26］。本课题组前期研究发现，在皮下接种THBEc1 细胞后，肿瘤灶人源NRP2 阳性，裸小鼠血清人源NRP2 水平显着升高，并与以肿瘤体积为特征的肿瘤生长呈良好正相关［17，27］。在本研究构建的THBEc1 致裸小鼠原位肺癌模型中发现，血清人源NRP2 水平可以作为监测实验动物肺内成瘤的诊断指标，根据ROC 曲线获得的最佳截断值123.00 ng·L-1能很好地诊断实验裸小鼠肺部是否成瘤。该发现也使得THBEc1 致裸小鼠原位肺癌模型具备了易于鉴定和监测肺内肿瘤生长状况的优点。未来在该模型的实际应用中，可考虑采用内眦静脉丛采血、尾采血等非终末采血方式，通过对血清人源NRP2 水平的测定，实现对肺内成瘤情况的动态监测。

综上所述，通过肺内注射接种THBEc1 细胞可建立裸小鼠原位肺癌模型，血清人源NRP2 可用于该模型的判断。本研究采用的小鼠肺内注射方法和安全注射体积可供参考。