64个蓝莓品种的ISSR分析

张立杰 谢丽雪 张小艳 李韬 黄立新

摘要：为明确不同蓝莓品种间的遗传关系，利用ISSR标记对64个蓝莓品种进行DNA指纹分析，构建蓝莓品种的指纹图谱数据库。从60条ISSR引物中筛选出9条重复性稳定的多态性引物，共扩增出条带161条，其中多态性条带159条，平均多态百分率达98.8%，引物 UBC841 可将 64 个蓝莓品种区分开。利用扩增结果进行聚类分析，在相似系数0.568的水平可将试材分为3个类群，并对其遗传关系进行探讨。

关键词：蓝莓；品种；ISSR；指纹图谱；遗传关系

中图分类号：S682.31                       文献标识码：A                        文章编号：2095-5774（2023）01-0011-07

ISSR Analysis of 64 Blueberry Cultivars

Zhang Lijie1，Xie Lixue1，Zhang Xiaoyan1，Li Tao1*，Huang Lixin2

（1Fruit Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China；

2 Shaowu Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs，Nanping，Fujian 354000，China）

Abstract：In order to clarify genetic relationship of different cultivars of blueberry，the inter-simple sequence repeat（ISSR）method was applied to analyze the DNA fingerprinting of 64 blueberry cultivars，and a fingerprints database was constructed. Nine ISSR primers，with high polymorphisms and good repeatability，were selected from 60 ISSR primers. Total 161 DNA bands were amplified，159 of which were polymorphic ，the average polymorphism percentage was 98.8%. These varieties could be satisfactorily distinguished by a single ISSR primer UBC841. UPGMA algorithm showed that 64 cultivars could be clustered into 3 groups using a genetic similarity coefficient threshold of 0.568，and their genetic relationships was evaluated .

Key words：Blueberry；Cultivars；ISSR；DNA fingerprinting；Genetic relationships

蓝莓，又名越橘、蓝浆果，为杜鹃花科 （Ericaceae） 越橘属 （Vaccinium） 植物。蓝莓被喻为世界第三代水果，可果实鲜食、加工或作为高级化妆品原料。蓝莓因其集约化、精细化栽培、符合现代果业要求且价格优势明显，成为中国新兴果业的代表，各個省份都在大力发展。

福建省属亚热带季风气候，土壤多为酸性的红壤、黄壤且有机质含量高，适合南高丛和兔眼蓝莓的生长。福建为蓝莓发展新区，早期种植多以民间引种试种为主，规模小，多点开花。据不完全统计，2016年，福建省蓝莓栽培面积约800 hm2，投产不足300 hm2，主要分布在龙岩、宁德、福州等地。栽培品种多样，包括‘奥尼尔‘夏普蓝‘密斯提‘莱格西‘威尔‘海岸‘顶峰‘灿烂‘园蓝‘粉蓝‘精华‘杰兔‘乌达德等。随着产业的发展和种植面积的增加，蓝莓品种和苗木市场混杂的问题日益突出，部分北高丛蓝莓品种如‘杜克‘南丰等也被引入，给相关蓝莓种植户造成极大损失。为此，开展蓝莓品种的鉴定评价成为福建蓝莓产业发展的迫切问题。

由DNA分子标记衍生的DNA指纹技术在鉴定品种真实性和纯度等方面是很有效的，其中ISSR 标记是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，目前已广泛应用于植物品种鉴定［1］、遗传图谱构建［2］及遗传多样性研究［3-4］等。该技术已运用于构建苹果［5］、杏［6］、柑橘［7］、枇杷［8］、龙眼［9］、火龙果［10］、猕猴桃［11］等果树的指纹图谱。本研究应用ISSR分子标记对64个蓝莓品种的遗传关系进行分析，建立DNA指纹图谱，为蓝莓品种调查、鉴别及蓝莓产业合理布局服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取64个蓝莓品种（表1），其中南高丛品种12个，北高丛品种34个，半高丛品种3个，兔眼品种11个，矮丛3个品种来自浙江蓝美农业有限公司，取其嫩叶作为研究试材。

1.2 蓝莓叶片DNA提取

采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒进行蓝莓叶片DNA提取，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定DNA的质量和浓度。最终将DNA稀释至25 ng·μL-1，置于 -20 ℃ 冰箱备用。

1.3  蓝莓ISSR反应体系的建立

ISSR-PCR反应体系由 2.0μL DNA模板、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer、2.5 μL dNTP、2.0 μL 10μmol·L-1引物、2.0μL        25 mmol·L-1 MgCl2、0.3μL5 U·μL   -1 Taq DNA polymerae和13.7μL ddH2O組成，总体积为25μL。ISSR引物序列参考加拿大哥伦比亚大学UBC Primer Set#9（University of British Columbia Biotechnology，UBC），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，重复35个循环；最后在72℃延伸10 min；4℃保存。PCR反应在Techne PCR仪上进行。电泳检测采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为 1×TBE，150V电压电泳4h，电泳结束后银染拍照。

1.4  ISSR引物的筛选及扩增产物多态性的统计分析

用 60条随机引物对任意一份DNA 样品在上述的反应体系及扩增程序中进行扩增，以筛选引物，引物需符合如下条件：条带清晰、空白中无或少假带、对所有样品均有质量好的条带。根据电泳图谱进行读带，电泳图谱中的每一条带记为一个分子标记。以清晰及能重复的条带记为“1”其余的为“0”，数据处理完后运用NTSYS-PC 2.0软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1  多态性ISSR引物的筛选

选择适宜的引物是构建DNA指纹图谱的关键因素之一。本研究从60条随机引物中筛选出9条带型好、多态性高、重复性好的引物。9条ISSR 引物对64个品种的扩增结果见表2，共扩增出条带161条，其中多态性条带159条，平均多态百分率达98.8% 。各引物扩增的条带数在5～25条之间。

2.2  64个蓝莓品种指纹图谱的构建

引物 UBC841 可以将 64份供试材料完全区分开来（图1），构建了 64 个蓝莓材料的 DNA 指纹图谱（表3）。

2.3  64个蓝莓品种的聚类分析

基于ISSR的扩增结果，采用UPGMA法进行相似系数计算和聚类分析，建立了64个蓝莓品种的聚类树状图（图2）。在相似系数0.568的水平，可分为3个品种群，第Ⅰ类聚集了13个品种，除‘瑞卡‘美登外，其余11个品种均为兔眼蓝莓。第Ⅱ类聚集了46个品种，包含了绝大多数的高丛、矮丛蓝莓，在相似系数0.58水平对该组进行亚分类，可分为4个亚组（表4），第1个亚组包含15个品种，其中‘比洛克西‘夏普兰等6个品种为南高丛蓝莓，‘钱德勒‘努益等8个品种为北高丛蓝莓，‘芝尼为矮丛蓝莓；第2个亚组包含20个品种，其中‘海岸‘密斯提等5个品种为南高丛蓝莓，‘玫瑰蓝‘康维尔等15个品种为北高丛蓝莓；第3个亚组包含8个品种，除‘北极星‘北村‘北陆3个半高丛蓝莓品种外，还包括‘鲁贝尔‘埃利奥特等5个北高丛蓝莓品种；第4个亚组包含3个品种，其中‘斯维克为矮丛蓝莓，‘米德‘达柔为北高丛蓝莓。第Ⅲ类聚集了5个品种，除‘库帕为南高丛蓝莓外，其余4个为北高丛蓝莓。

3 讨论

3.1  64个蓝莓品种的遗传关系分析

多数蓝莓品种间在外观形状上难以区分，DNA分子标记已成为在蓝莓品种鉴定及亲缘关系分析方面最有效的方法。在蓝莓资源上，已采用SSR［12］、RAPD［13］、ISSR［14］和SRAP［15］等标记技术进行遗传多样性、亲缘关系分析以及品种鉴定研究。

本研究聚类结果表明，兔眼蓝莓、半高丛蓝莓可单独聚在一组，说明蓝莓品种间的遗传关系与栽培类型之间存在着一定的对应关系。崔建民［16］等对93个蓝莓种质资源进行SSR分子标记分析也显示在遗传相似系数0.70处，北高丛蓝莓、兔眼蓝莓分别聚为一类；但是本研究中存在北高丛、南高丛及矮丛的品种混杂聚类，说明仅根据蓝莓栽培类型来分类并不能准确反映其遗传关系，这可能是因为现在栽培的大多数蓝莓品种均是由几个最原始的品种相互杂交而得到的［14］。

3.2  蓝莓DNA指纹图谱的构建

目前，已建立多种果树的指纹图谱，包括苹果、梨、李、桃、杏、柑橘、葡萄、柿、樱桃、梅、油橄榄、阿月浑子、番荔枝、树莓、番木瓜、枣等。蓝莓指纹图谱方面研究较少，仅见除郑姗等［17］以ISSR标记构建17个品种的DNA指纹图谱外，高雄梅［18］、 王亮［19］、徐国辉［20］等以EST-SSR开展了相关研究，为此，开展蓝莓品种的DNA指纹图谱鉴定有助于解决国内蓝莓苗木混杂及乱命名现象。

本研究采用的ISSR标记不仅结合了RAPD、AFLP的大部分优点［21］，且多态性比RAPD、 AFLP、SSR丰富，多态性占总条数的98.8%。下一步研究拟将ISSR技术与SCAR标记技术相结合，增加多态性引物数量，开发特异的SCAR标记，构建更准确、稳定的蓝莓DNA指纹图谱，为蓝莓品种鉴定等相关研究服务。

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（责任编辑：冯新）