异泽兰黄素通过改善腹侧海马GABAa 受体传递缓解大鼠酒精戒断焦虑样行为

李露露，焦 宇，姜 敏，李秋月，吴朋烊，马淑丽，郑晓宇，赵容杰，赵正林

（齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

酒精中毒（Alcoholism）的危害极大，但其治疗成功率极低[1]。酒精中毒患者戒酒一段时间后复饮是其治疗的最大难点，而酒精戒断（EtOH Withdrawal，EtOHWI）引起的情感障碍是导致复饮的根源之一[2]。临床研究和实验动物研究表明，EtOHWI 后酒精中毒患者和实验动物均表现出显著的焦虑障碍（症），为了缓解此症状的痛苦，酒精中毒患者和实验动物会觅酒和重新饮酒[3-4]。目前临床上应用的治疗酒精中毒的药物地西泮或劳拉西泮等苯二氮卓类药物主要通过缓解患者的焦虑症而实现其治疗效果[5]。虽然此类药物表现出一定的疗效，但其本身具有较强的成瘾性[6]，继而很大限制其进一步使用。很显然，研发具有良好的抗焦虑效应，并且无成瘾性的新药是目前酒精中毒治疗所面临的重大课题。

异泽兰黄素（Eupatilin，Eptl），中药艾叶中的重要黄酮类成份，也广泛存在于多种菊科蒿属类植物中[7]，而艾叶在民间常被做食用原料或佐料使用[8]。已知Eptl 具有良好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护等药理活性[9-10]，并且发现Eptl 通过海马（Hippocampus，Hippo）的神经传递调节和抗炎等机制抑制小鼠抑郁样行为[11-12]。海马是大脑边缘系统的重要结构，分布着大量的γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）能神经[13]，而GABAaR 是酒精的主要作用点，且GABA 能神经功能紊乱是导致大量饮酒所致情感障碍的重要因素[14]。因此，本研究首先在行为和应激激素的角度观察Eptl 对大鼠EtOHWI 焦虑样行为的作用，以vHippo 的GABA 能神经传递功能变化、炎症和氧化应激等作为靶点探讨Eptl 的作用机制，旨在为Eptl 研发成新的抗EtOHWI 焦虑症的药物提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

32 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 随机选取8 周龄，体重均为200～220 g，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供，使用许可证号：SYXK（黑）2021-013。实验大鼠均在20～23 ℃，湿度40%～50%，具有自动空气清洁设备的专用IVC 鼠笼饲养，自由饮水饮食。本实验已通过齐齐哈尔医学院实验动物伦理委员会批准（批号：QMU-AECC-2023-68），且所有操作均按照相关指南执行；小鼠海马神经细胞系HT22

以含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的Dulbecco's modified Eagle's medium 高糖培养液在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中孵育，BeNa Culture Collection；异泽兰黄素（纯度≥98%）成都德斯特生物科技有限公司；总蛋白测定试剂盒、MDA、CAT、T-SOD、GSH 检测试剂盒、Nrf2 抗体 碧云天生物技术公司；HO-1 抗体 Santa Cruz Biotechnology；GABAaRα1、GABAaRα2 抗体 索莱宝科技有限公司；大鼠CORT、大鼠GABA、大鼠TNF-α、大鼠IL-6 ELISA 检测试剂盒 上海酶联生物科技有限公司。

RL20170223 大鼠旷场（Open field，OF）实验箱、RL20170210 高架十字迷宫（Elevated plus maze，EPM）上海软隆科技发展有限公司；多功能酶标仪奥地利Tecan 公司；1658001 小型垂直电泳槽、1703935 电泳转印系统 美国BIO-RAD 公司；UVP Chemstudio touch 多功能成像仪、qTOWER3G 荧光定量梯度基因扩增仪 德国Analytikjena 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的分组、模型建立和给药 适应性饲养1 周后，将实验大鼠随机分为4 组，分别为生理盐水对照组、酒精戒断（EtOHWI）模型组、Eptl 低剂量治疗组和Eptl 高剂量治疗组，每组各8 只。除生理盐水对照组外，其余各组每天1 次腹腔注射3 g/kg EtOH（稀释于生理盐水，20%的容积比），共28 d。戒断3 d 制备EtOHWI 模型，生理盐水对照组以生理盐水代替EtOH[15]。在戒断3 d 期间，每天对Eptl 低剂量治疗组（10 mg/kg）和Eptl 高剂量治疗组（30 mg/kg）分别灌胃1 次[16]（Eptl 灌胃前先溶解于二甲基亚砜，后用生理盐水进行稀释）。生理盐水对照组和EtOHWI 模型组灌胃生理盐水。在第3 次给药30 min 后，对各组大鼠进行OF 和EPM 检测，观察行为学变化。

1.2.2 行为学检测 旷场试验（OF）：首先，将各组大鼠放置于旷场实验箱的正中央区域（50 cm×50 cm×50 cm），采用视频系统开始记录5 min 内大鼠的活动情况。观察指标为：中央区域的活动距离（mm）及活动时间（s）[17]；高架十字迷宫试验（EPM）：EPM 由从地面50 cm 升高的十字形长宽（50 cm×10 cm）相同的开放臂（无侧壁）和闭合臂（有侧壁）垂直交叉构成。OF 检测结束10 min 后进行EPM 实验，将各组大鼠放置于迷宫中央区域，头均朝向开放臂方向，采用视频系统开始记录5 min 内大鼠的活动情况。观察指标为：开放臂进入次数百分比（%）和开放臂滞留时间百分比（%）。行为学检测期间实验室保持通风安静，每只大鼠检测后，用0.1%醋酸擦干仪器除味[18]。

1.2.3 血清中CORT 含量测定 行为学检测结束后，大鼠安乐死后收集血液至1.5 mL 离心管中，在4 ℃、3000 r/min 离心15 min 后收集血清，严格按照ELISA试剂盒说明书检测CORT 水平，结果以ng/mL 表示。

1.2.4 vHippo 中GABA 含量测定 大鼠安乐死处理后取出大脑，根据大鼠脑定位图谱[19]，分离出vHippo并称重，按5%的比例于PBS 中充分匀浆，8000 r/min离心10 min，收集上清严格按照大鼠GABA 测定试剂盒说明书检测GABA 水平，结果以μmol/L 表示。

1.2.5 Western blot 检测vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2、HO-1 蛋白表达 将收集的vHippo于RIPA 蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制剂）中充分研磨，12000 r/min 离心5 min 取上清液，用BCA 试剂盒进行蛋白定量，并按照常规操作方法进行电泳、转膜、封闭、Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，再加入Ⅱ抗室温摇床孵育2 h 后，用ECL 显色，利用多功能凝胶成像系统扫描并用ImageJ 软件进行灰度值分析，以GAPDH作为内参对照。

1.2.6 vHippo 中氧化应激指标和炎症因子的测定将收集的vHippo 按10%的比例于PBS 中充分匀浆，3000 r/min 离心20 min，收集上清严格按试剂盒说明书分别检测vHippo 中氧化应激指标MDA、T-SOD、CAT 和GSH 水平以及炎症因子IL-6 和TNF-α。

1.2.7 qPCR 检测vHippo 中GAD67 mRNA 相对表达量 将收集的vHippo 采用Trizol Reagent 法提取RNA 并检测其浓度和纯度，严格按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。基因引物序列如下：GAD67，Forward：CATCATGGCGGCTGGTACAC AG；Reverse：GTGACTGTGTTCTGAGGTGAAGA GG。GAPDH，Forward：AATCCTGGGCGGTACA ACTC；Reverse：GTTCACACCGACCTTCACCA。qPCR 反应条件为预变性95 ℃、3 min，变性95 ℃、15 S，退火55 ℃、30 S，延伸72 ℃、20 S，共进行43个循环，然后计算△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=处理组△Ct-对照组△Ct，最后计算2-△△Ct值，然后进行统计分析。

1.2.8 MTT 法检测HT22 细胞活力 根据文献[20]的方法，收集生长状态良好的HT22 细胞，制备细胞悬液，以每孔4×103个接种于96 孔板中，每孔100 μL，加入不同浓度（50、100、200、400、800、1000 μmol/L）的H2O2培养24 h。准备相同细胞加入不同浓度（3、10、30、60 μmol/L）的Eptl 培养24 h。接种相同细胞，预处理组加入30 μmol/L 的Eptl 预处理2 h，与H2O2模型组同时给予200 μmol/L H2O2刺激，培养24 h，每组均设3 个复孔。然后加入10 μL MTT染色液，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中继续孵育4 h，每孔加100 μL Formanzan 溶解液继续孵育5 h待结晶完全溶解后用酶标仪检测570 nm 处吸光度（OD）值，并计算细胞存活力，筛选最佳H2O2和Eptl处理浓度。

1.2.9 HT22 细胞分组、给药以及免疫荧光实验 收集生长状态良好的HT22 细胞，爬片到经组织培养物处理的圆形玻片上，分为Control 组（空白组）、H2O2模型组（200 μmol/L H2O2）和Eptl 预处理组（30 μmol/L Eptl+200 μmol/L H2O2）。Eptl 预处理组以30 μmol/L Eptl 预处理2 h 后，与模型组同时给予200 μmol/L H2O2培养24 h，空白组用正常培养基培养。造模完成后经PBS 润洗3 min，10%中性甲醛固定40 min，0.1% Triton-X 穿透10 min，5% BSA 封闭0.5 h，加入Nrf2 Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗室温孵育2 h，DAPI核染色10 min，抗荧光淬灭剂封片后于倒置荧光显微镜观察。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行数据分析，数据均采用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way，ANOVA），组间两两比较采用Newman-Keuls 法进行检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Eptl 对EtOHWI 大鼠行为学变化的影响

OF 是利用啮齿类动物对开阔的新异环境的恐惧和探究能力来反映动物的自发活动情况和焦虑心理。EPM 是利用啮齿类动物对新异环境的探究能力和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来检测动物的焦虑状态[21-22]。由表1 可知，在OF 检测中，EtOHWI 模型组大鼠在中央区域的活动距离和活动时间均极显著低于生理盐水对照组（P＜0.01）；与EtOHWI 组比较，Eptl 低、高剂量治疗组大鼠在OF 中央区活动距离极显著增加（P＜0.01），分别为70.62%和124.21%，活动时间显著增加（P＜0.05 或P＜0.01），分别为251.75%和371.62%；在EPM 检测中，EtOHWI 模型组大鼠开放臂进入次数和开放臂滞留时间百分比均极显著低于（P＜0.01）生理盐水对照组；与EtOHWI 模型组比较，Eptl 低、高剂量治疗组大鼠开放臂进入次数百分比显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），分别为110.33%和207.32%，滞留时间百分比显著增加（P＜0.05 或P＜0.01），分别为99.56%和184.18%，表现出大鼠对开放臂的探索趋势显著升高；在组间两两比较中，Eptl 高剂量治疗组大鼠开放臂进入次数和开放臂滞留时间百分比均显著高于（P＜0.05）低剂量治疗组，说明Eptl 对EtOHWI 大鼠焦虑样行为的治疗具有剂量依赖性。上述检测指标提示，大鼠EtOHWI 焦虑样模型制备成功。在EtOHWI期给予Eptl 治疗后，焦虑样行为显著减轻。

表1 Eptl 对EtOHWI 大鼠行为学变化的影响（n=8）Table 1 Effect of eupatilin on the changes of EtOHWI rats (n=8)

2.2 Eptl 对EtOHWI 大鼠血清CORT 水平、vHippo中GABA 含量的影响

下丘脑-垂体-肾上腺轴（Hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA）是机体内最为重要的神经内分泌系统之一。HPA 轴中CORT 含量变化可作为直接评价啮齿类动物焦虑程度的重要指标，两者呈正相关[23]。如表2 所示，各组大鼠血清CORT 检测结果如下。与生理盐水对照组比较，EtOHWI 模型组大鼠血清CORT 含量极显著升高（P＜0.01）；与EtOHWI模型组比较，Eptl 低、高剂量治疗组血清CORT 水平均极显著降低（P＜0.01）；组间两两比较显示，Eptl低、高剂量治疗组间CORT 水平差异具有统计学意义（P＜0.01），表明两者具有极显著的剂量依赖性，说明Eptl 显著降低了EtOHWI 大鼠血清CORT 的上升趋势，减轻了对EtOH 戒断焦虑样行为。GABA是大脑中广泛分布的抑制性神经递质，EtOH 与GABA相互作用会增强EtOH 的负性强化作用，在EtOH 成瘾和依赖中起着重要作用。苯二氮卓类药物镇静、抗焦虑和抗惊厥作用与GABA 系统的激活有关，本研究结果与之呼应[24]。ELISA 检测结果显示，与生理盐水对照组比较，EtOHWI 模型组大鼠vHippo 中GABA 含量极显著降低（P＜0.01）；与EtOHWI 模型组比较，Eptl 低、高剂量治疗组vHippo 中GABA 含量均显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。此结果说明，在EtOHWI 大鼠发病过程中vHippo 中GABA 的降低会导致焦虑样行为，而Eptl 可通过上调vHippo 中GABA 水平改善EtOHWI 大鼠焦虑样行为。

表2 Eptl 对EtOHWI 大鼠血清CORT 水平、vHippo 中GABA 含量的影响（n=8）Table 2 Effects of eupatilin on the level of serum CORT and the ventral hippocampal GABA content concentration of EtOHWI rats (n=8)

2.3 Eptl 对EtOHWI 大 鼠vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响

GABAaR 是维持和控制大脑神经元兴奋的关键蛋白，GABA 通过与其受体GABAaR 结合发挥生理功能，焦虑症的发生与GABAaRα1、GABAaRα2 的改变密切相关[25-26]。长期的EtOH 依赖或戒断会导致机体处于氧化应激状态，其中Nrf2/HO-1 是氧化应激反应重要的信号通路。Western blot 检测结果如图1，与生理盐水对照组比较，EtOHWI 模型组大鼠vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2 和HO-1蛋白表达极显著减少（P＜0.01）；与EtOHWI 模型组比较，Eptl 低、高剂量治疗组大鼠vHippo 中GABAa-Rα1、GABAaRα2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；组间两两比较显示，Eptl 低、高剂量治疗组间GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2 和HO-1 蛋白表达均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），具有剂量依赖性。由此可推断，GABAaRα1、GAB AaRα2 蛋白下调可能是介导EtOHWI 焦虑症的重要机制，而Eptl 能纠正其紊乱发挥抑制EtOHWI 焦虑样行为的效应。Nrf2/HO-1 抗氧化系统可能参与了Eptl 的抗氧化过程从而保护了vHippo 氧化应激的损伤。

图1 各组大鼠vHippo 中GABAaRα1、GABAaRα2、Nrf2、HO-1 蛋白表达（n=8）Fig.1 Protein expression of ventral hippocampal GABAaRα1,GABAaRα2,Nrf2 and HO-1 of each group rats (n=8)

2.4 Eptl 对EtOHWI 大鼠vHippo 中氧化应激指标和炎症因子水平的影响

各组实验大鼠vHippo 中氧化应激指标和炎症因子的变化如表3 所示，与生理盐水对照组比较，EtOHWI 模型组大鼠vHippo 中MDA 水平呈极显著升高（P＜0.01），而T-SOD、CAT、GSH 活性极显著降低（P＜0.01））；与EtOHWI 模型组比较，Eptl 低、高剂量治疗组大鼠vHippo 中MDA 水平极显著降低（P＜0.01），T-SOD、CAT、GSH 活性显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；在组间两两比较中，Eptl 高剂量治疗组大鼠较Eptl 低剂量治疗组vHippo 中MDA水平显著降低（P＜0.05），有剂量依赖性。在炎症因子的检测中，EtOHWI 模型组大鼠vHippo 中IL-6、TNF-α含量较生理盐水对照组极显著升高（P＜0.01），而Eptl 低、高剂量治疗组大鼠vHippo 中IL-6、TNF-α含量较EtOHWI 模型组大鼠显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；在组间两两比较中，Eptl 高剂量治疗组大鼠较Eptl 低剂量治疗组vHippo 中TNF-α显著降低（P＜0.05），表现出剂量依赖性。因此可以推断，EtOHWI 期大鼠vHippo 中发生了氧化应激和炎症反应，失去了内环境稳态的动态平衡，诱导了vHippo中GABA 能神经传递的紊乱，进一步说明EtOHWI焦虑症发病机制中大脑vHippo 中氧化应激和炎症反应的重要作用。Eptl 治疗后vHippo 中氧化应激指标和炎症因子水平紊乱得到显著改善，缓解了EtOHWI 对大鼠vHippo 的损伤。

表3 Eptl 对EtOHWI 大鼠vHippo 氧化应激指标和炎症因子水平的影响（n=8）Table 3 Effects of eupatilin on the oxidative stress and inflammatory factors in ventral hippocampal of EtOHWI rats (n=8)

2.5 Eptl 对EtOHWI 大鼠vHippo 中GAD67 mRNA相对表达量的影响

qPCR 检测结果如图2 所示，与生理盐水对照组比较，EtOHWI 模型组大鼠vHippo 中GAD67 mRNA相对表达量极显著减少（P＜0.01）；与EtOHWI 模型组比较，Eptl 低、高剂量治疗组大鼠vHippo 中GAD67 mRNA 相对表达量显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；组间两两比较显示，Eptl 低、高剂量治疗组间GAD67 mRNA 相对表达量差异具有统计学意义（P＜0.05），具有剂量依赖性。此结果进一步说明了GABAa 神经传递紊乱可能是介导EtOHWI 焦虑症的重要机制，给予Eptl 可以恢复GABAa 神经的生理功能，减轻EtOHWI 给机体带来的损伤，缓解焦虑症状。

图2 各组大鼠vHippo 中GAD67 mRNA 相对表达量（n=8）Fig.2 Relative expression of ventral hippocampal GAD67 mRNA of each group rats (n=8)

2.6 Eptl 对H2O2 诱导的HT22 细胞活力的影响

如图3 所示，H2O2和Eptl 单独处理后观察对HT22 细胞活力的影响，H2O2最适刺激浓度为200 μmol/L，Eptl 预处理浓度为30 μmol/L。与空白组比较，H2O2模型组细胞活力极显著降低（P＜0.01）；与H2O2模型组比较，30 μmol/L Eptl 预处理组的细胞活力显著升高（P＜0.01）。

图3 Eptl 对H2O2 诱导的HT22 细胞活力的影响（n=3）Fig.3 Effect of eupatilin on the viability of H2O2-induced HT22 cells (n=3)

2.7 Eptl 对H2O2 诱导的HT22 细胞中Nrf2 表达的影响

如图4 所示，Control（空白）组中，Nrf2 主要存在于胞质内，胞核中表达极少，而H2O2模型组胞核中Nrf2 的表达较Control 组极显著升高（P＜0.01）；与H2O2模型组比较，Eptl 预处理组细胞核中Nrf2 的表达显著减少（P＜0.05），且与Control（空白）组比较，并无显著性差异（P＞0.05）。

图4 Eptl 对H2O2 诱导的HT22 细胞中Nrf2 表达的影响（200×，n=3）Fig.4 Effect of eupatilin on the expression of H2O2-induced HT22 cells (200×,n=3)

3 讨论与结论

酒精中毒会引起酒精依赖，戒断会导致睡眠障碍、焦虑和抑郁等精神症状，给社会和个人的生活带来严重的危害[27]。本研究发现EtOHWI 期给予Eptl对抑制大鼠的EtOHWI 焦虑样行为有积极作用。EtOHWI 期血液中 CORT 水平增高被认为是大鼠焦虑的激素学基础[27]。本研究中观察到EtOHWI 大鼠血清CORT 水平的极显著升高（P＜0.01），且两个剂量的Eptl 均可有效地抑制其增高，此结果不仅从激素学角度支持了Eptl 抗EtOHWI 焦虑的行为学的作用，而且与行为学检测结果相印证初步确定了Eptl对EtOHWI 焦虑样行为的改善作用。

本研究在不同角度探讨Eptl 的抗焦虑作用机制，其中vHippo 作为EtOHWI 焦虑症的解剖组织学靶点，解释了Eptl 作用机制。Hippo 是学习记忆等认知功能的关键部位，也是介导焦虑等情感障碍的重要结构，分布有大量的GABAaR[28-29]。在中枢神经系统（Central nervous system，CNS），GABA 从突触前膜被释放后，与突触后膜的GABAaR 结合而发挥抑制神经传递作用，因此，GABA 合成和释放以及GABAaR 表达直接影响GABAaR 传递效应[30-31]。GAD65 和GAD67 是中枢GABA 合成的限速酶，后者一般以功能饱和状态存在，主要负责胞浆内的GABA 合成，但前者多数受到一些刺激后才被激活发挥作用。因此，组织的GABA 水平主要由GAD67表达量所决定[32-33]。研究发现，情感障碍患者的Hippo 存在GAD67 的显著下调并伴有GABAaR 传递异常[34]，表明GABA 合成能力下降是其发病机制之一。在Hippo，GABAaR 和GABAbR 是介导GABA 神经传递的主要受体，其中GABAaR 作为抑制性离子通道受体的代表，是介导EtOH 中枢作用的重要物质基础。GABAaR 是由5 个亚基围绕一个中心氯离子通道的五聚体，有19 种亚型，分布于不同的中枢神经系统，具有特定的生理功能[35]。苯二氮卓类药物正是通过增强GABA 与其受体的结合发挥镇静催眠和抗焦虑作用，尤其在海马中体现[36-37]。在本研究中，EtOHWI 大鼠模型vHippo 的GABA 水平极显著降低（P＜0.01），并伴有GAD67 mRNA 相对表达量的减少，表明在EtOHWI 期，GABA 合成与释放减少，同时，EtOHWI 大鼠vHippo 中GABAaR 的α1和α2 亚基蛋白表达量均极显著减少（P＜0.01），这些结果与上述其它研究者的结果一致。综上，vHippo的GABAa 神经传递功能下降是介导EtOHWI 焦虑症重要机制，而Eptl 通过改善其发挥抗EtOHWI 焦虑症的效应。

炎症反应和氧化应激存在相互作用，它们所致的损伤通常被认为是，长期饮用EtOH 或EtOHWI导致的CNS（包括Hippo ）功能紊乱的潜在因素。Jeong 等[12]曾在研究中发现，Stillen（Eptl 的别名）可降低Hippo 的IL-6 和TNF-α等炎症因子的表达以发挥抗小鼠抑郁症的效应。在本研究发现，EtOHWI大鼠模型vHippo 的IL-6 和TNF-α与生理盐水对照组相比，极显著升高（P＜0.01），而戒断期低高剂量Eptl 的治疗均显著抑制了这些现象，表明Eptl 良好的抗炎作用可能是保护或逆转长期饮用EtOH 或戒断期vHippo 的GABAa 神经传递损伤的基本机制之一。与此相似，Tiwari 等[38]的研究也发现，长期EtOH 引起Hippo 的氧化应激损伤因子的表达增多，而白藜芦醇通过缓解氧化应激损伤等机制改善长期EtOH 所致大鼠认知障碍。同样，在本研究中，检测到EtOHWI 模型大鼠vHippo 的MDA 水平增高，而CAT 和T-SOD 的活性降低，且Eptl 低、高剂量治疗显著改善氧化应激损伤，表明Eptl 的抗氧化应激作用也可能是它保护vHippo 的GABAa 神经传递治疗EtOHWI 焦虑症的重要机制之一。Nrf2/HO-1 是细胞中重要的抗氧化应激系统，本研究检测了vHippo的HO-1 和Nrf2 的蛋白表达，结果发现EtOHWI 模型大鼠vHippo 的此两种蛋白表达有极显著降低（P＜0.01），但Eptl 治疗显著提高了它们的表达（P＜0.05），表明Nrf2/HO-1 抗氧化系统可能参与Eptl 的抗氧化过程，此结果与课题组前期的研究相符合[20]，也在本研究的细胞实验中进一步得到了证实。在利用啮齿类Hippo 来源的HT22 细胞进行的荧光免疫染色中发现，H2O2诱导组的HT22 细胞中Nrf2 向细胞核内的进入量极显著增多（P＜0.01），通常Nrf2 存在于胞浆内，与胞质接头蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）结合在一起。当氧化应激或一些信号因子存在的情况下，Nrf2 与Keap1 分离进入到胞核内与抗氧化反应元件（Antioxident responseelement，ARE）结合启动HO-1 和NQO-1 等抗氧化因子的转录过程[39]。因此，此结果显示HT22 受到氧化应激攻击时的细胞保护反应，但在同样的免疫荧光染色中发现，30 μmol/L Eptl 预处理的HT22 细胞中Nrf2 进入胞核的量反而减少，说明此浓度的Eptl 预处理通过某种机制减弱了H2O2诱导的氧化应激的攻击，保护了HT22 受到氧化应激的损伤。上述细胞实验结果和组织中 Nrf2、HO-1 蛋白表达的结果综合说明了，EtOHWI 期间存在 vHippo 的抗氧化应激保护通路紊乱，而Eptl 通过纠正和改善这些紊乱缓解氧化应激对GABAa 传递的损伤，进而表现出抑制EtOHWI 焦虑症的疗效。

综上所述，本研究得出EtOHWI 期给予Eptl 能缓解EtOHWI 大鼠焦虑样行为，这种效应可能通过Eptl 的抗炎抗氧化作用所介导，从而改善大鼠 vHippo的 GABAaR 传递紊乱。本研究的实验结果为Eptl可能成为治疗EtOHWI 焦虑症及酒精中毒的新药研发提供新的基础实验数据和依据，且考虑到艾叶是民间常用的食用原料和佐料，本研究的结果也为艾叶的药用和保健作用增添新的科学依据。

客座主编

杨栩，男，食品科学与工程博士后，高级工程师，现任天津市食品安全检测技术研究院食品安全风险研究中心主任。研究方向为天然产物提取、结构表征、生物活性，药食同源功能性食品研制和功效安全性评价。天津市医疗健康学会第一届精准检测专业委员会副主任委员、《精细化工》和《食品工业科技》青年编委、Bentham 科学出版社大使、国家市场监管总局技术保障专项、科研成果奖评审专家、天津市健康科普专家、天津市食品安全抽检监测专家。主持承担国家重点研发计划、国家科技重大专项、食品安全国家标准、天津重点研发计划、国家市场监管总局等国家/省部级项目12 项。以第一/通讯作者在Food Chemistry、International Journal of Biological Macromolecules等期刊发表论文20 余篇，获批国家发明专利1 项。

彭鑫，博士，天津大学生命科学学院副教授，硕士生导师，2016 年～2017 年曾在美国威斯康星大学麦迪逊分校进行公派访学。研究方向为药食同源物质中天然产物的提取分离、筛选制备与功能研究。主持国家自然科学基金、天津市自然基金等项目10 余项，以第一/通讯作者在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Chemistry和Food &Function等期刊发表论文30 余篇，其中JCR 一、二区论文20 余篇，ESI 高被引论文1 篇。兼任《食品工业科技》和《中国调味品》青年编委，马来西亚硕士学位论文海外评审专家，担任多个SCI 高水平期刊审稿人。2016 年入选天津大学“北洋学者青年骨干教师计划”和天津市“131”人才计划第三层次人才。