没食子酸环氧化物改性明胶的结构及性能表征

韩庆港，张 熙，高仕宇，李可心，黄赣辉

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）

明胶是一种来源于动物皮肤与骨骼等结缔组织中胶原蛋白的亲水性生物大分子，常用于食品、医药、材料等行业[1-3]。明胶分子链上具有丰富的活性基团，如氨基、羟基、羧基等，引入其他物质可以实现对明胶的非共价或共价交联改性[4-5]。其中通过化学反应进行共价交联改性可以极大的改善明胶的性能[6]，扩大明胶的使用范围和经济价值[7-8]。常用的化学改性剂有醛基交联剂，比如甲醛、乙二醛、戊二醛等，但毒性限制其在食品和医药领域的应用[9-10]。环氧化物中环氧基的三元环结构，因电荷极化和环张力易开环，与胺类、醇类、酚类、羧酸等化合物有高反应活性[11-12]。Zeng 等[13]将环氧化物交联剂引入大豆蛋白粘合剂中，构建了一个密集的交联网络，提高粘合剂的耐水性。在以前的研究中还发现，碱性环境中环氧基优先与氨基发生反应[14]。Zheng 等[15]将胶原蛋白与环氧化多糖交联后热稳定性、力学性能、亲水性提高，获得了高度稳定的伤口敷料。结合相关研究可以发现，将环氧化物用于交联改性明胶具有理论可行性。

双酚A 型环氧树脂是目前使用最广泛的环氧树脂，然而有研究表明双酚A 对人体健康有负面影响，因此寻找无害的化合物代替双酚A 成为一种研究方向[16-17]。通过无毒、无害、高生态友好性的天然有机化合物合成环氧化物逐渐受到人们的关注，例如木质素、植物油、松香、腰果酚、单宁、香兰素、丁香酚等[18]。没食子酸（Gallic acid，GA）是一种衍生于单宁的天然多酚，在自然界中存量很大，具有一定的生物亲和性[19]。已有一些研究将没食子酸通过化学手段引入环氧基团获得了安全、无毒的天然多酚型环氧化物[20]。虽然合成了安全无毒的环氧化物，但目前还没有使用其改性明胶的研究，将两者结合得到的改性明胶有潜力应用于食品、医药领域。

本研究首先以没食子酸为原料合成了没食子酸环氧化物（Gallic acid epoxy，GAE），然后将其作为改性剂对明胶进行改性，比较了GAE 与明胶不同用量配比对结构和性能的影响，以期为明胶的改性提供一种新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

A 型猪皮明胶（～300 g Bloom）西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；没食子酸、溴丙烯、间氯过氧苯甲酸（≥85%，m-CPBA）、4,4'-硫代双（6-特丁基间甲酚）上海麦克林生化科技有限公司；无水碳酸钾、氯化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、无水硫酸镁、氢氧化钠等化学试剂、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂 分析纯，国药试剂；GF254 薄层色谱硅胶、柱层层析硅胶（200～300目）青岛海洋化工厂。

LC-WB-2+磁力搅拌恒温水浴锅 上海力辰仪器科技有限公司；PHS-25 雷磁酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；F-4500 荧光分光光度计 日本日立公司；Nicolet is50 傅里叶变换红外光谱仪、K-Alpha X 射线光电子能谱仪 赛默飞世尔科技有限公司；D8 ADVANCE X 射线衍射仪 德国布鲁克公司；OCA20 全自动接触角测量仪 德国Dataphysics 公司；STA449 F3 同步热分析仪 德国耐驰公司；CMT5205 微机控制电子万能试验机 三思永恒科技（浙江）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GAE 的制备 通过烯丙基化和环氧化两步反应制备GAE[21]，反应过程如图1 所示。第一步烯丙基化：将3.4 g GA 加入100 mL DMF 搅拌溶解后加入11.06 g 碳酸钾。随后，滴加12.10 g 溴丙烯，搅拌30 min 后升温至30 ℃反应48 h。反应完成后，加入蒸馏水稀释后用乙酸乙酯提取。有机相用饱和NaCl 溶液洗涤并真空浓缩干燥，产物通过硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯：90/10）纯化。第二步环氧化：将上一步得到的产物取3.3 g 加入50 mL 二氯甲烷搅拌溶解。将15 g m-CPBA 和0.11 g 4,4'-硫代双（6-特丁基间甲酚）溶于200 mL 二氯甲烷后在30 min内滴加至反应体系中搅拌1 h，随后升温至40 ℃反应48 h。反应完成后，使用亚硫酸钠、碳酸钠和饱和氯化钠溶液洗涤并真空浓缩干燥，产物经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯：50/50）纯化。GAE 的环氧值通过盐酸-丙酮法测定为0.9，理论值为1.01。

1.2.2 GAEG 的制备 原料配比见表1 所示，反应过程如图2 所示。明胶溶解后使用1 mol/L NaOH溶液调节pH 至10.0，在高速搅拌下将GAE 滴加至反应体系中。45 ℃下反应10 h，反应期间每小时测量一次pH 并调节至10，反应完成后得到GAEG 溶液。加入甘油（0.3 g/g 明胶）搅拌30 min 混合均匀，脱气后倒入塑料培养皿，30 ℃烘箱中干燥12 h 得到膜样品，剥离后于25±1 ℃和相对湿度50%±2%的条件下平衡48 h 用于后续测试。

图2 GAE 与明胶的反应过程Fig.2 Process of GAE with gelatin

表1 明胶与GAEG 的原料配比Table 1 Formulations of gelatin and GAEG

1.2.3 荧光胺法测定伯胺基浓度并计算交联度 使用荧光胺法测定甘氨酸和明胶的伯胺基浓度[22]。以385 nm 为激发波长，486 nm 为发射波长，测量荧光强度与甘氨酸伯胺基浓度的关系并绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=-0.40559+12.30497X（R2=0.99965）。根据得到的甘氨酸标准曲线计算得出明胶质量浓度与伯胺基浓度的对应关系，计算得出明胶的伯胺基浓度。根据以下公式计算得出明胶与GAE 的交联度：

式中：CG是GAE 改性明胶后的伯氨基浓度（mmol/g）；C0是纯明胶的伯氨基浓度（mmol/g）。

1.2.4 红外光谱分析 使用傅里叶变换红外光谱仪对样品进行扫描分析。分辨率为4 cm-1，扫描波长为4000～500 cm-1，使用衰减全反射法（ATR）进行测试。使用PeakFit 4.12 软件对波数在1600～1700 cm-1（酰胺I 带）范围内的图谱进行基线校正、去卷积、二阶导数拟合至相关系数R2＞0.999，得到子峰图谱后根据峰位和峰面积计算对应的二级结构组成。

1.2.5 X 射线衍射分析 使用X 射线衍射仪对改性明胶膜样品进行分析。靶材使用钴靶，工作电压40 kV，工作电流50 mA，扫描范围5°～30°，扫描速度2°/min。

1.2.6 X 射线光电子能谱分析 使用X 射线光电子能谱仪对改性明胶膜样品进行分析。分析室真空度5×10-10Pa，激发源采用Al ka 射线（hv=1486.68 eV），工作电压15 kV，灯丝电流10 mA，测试通能为50 eV，步长0.05 eV，以C1s=284.80 eV 为能量标准进行荷电校正。

1.2.7 溶胀率测定 将GAEG 膜裁成1 cm×1 cm 的方形并称重，然后将其浸入蒸馏水中，于37 ℃下溶胀，之后每隔一定时间称重一次。溶胀率根据以下公式计算：

式中：Ww为膜吸水溶胀后的重量（g）；W0为膜的初始重量（g）。

1.2.8 水接触角测定 使用接触角测量仪测定膜的水接触角。将3 cm×3 cm 的膜样品固定于载玻片上，置于水平移动平台上，通过微量注射器将2 μL 超纯水滴加至膜表面。

中国高铁要走出国门，合作国目前的政治社会环境也是一个不可忽视的因素，复杂的地域政治因素同样会造成影响。例如我国在2015年印度高铁项目竞标中取得了胜利，然而同一年安倍出访印度，莫迪总统在12月13日选择了让日本修筑印度高铁，虽然日本提出的方案中贷款政策相较我国更加优惠，但其中也掺杂着政治因素。

1.2.9 脱水率测定 将膜样品裁成1 cm×1 cm 的方形并称重，然后将其置于105 ℃烘箱中脱水，每隔一段时间称重一次。脱水率根据以下公式计算：

式中：G0为膜的初始重量（g）；Gd为膜失水后的重量（g）。

1.2.10 同步热分析 使用同步热分析仪对膜进行热重分析和差示扫描量热。取4 mg 左右的样品以10 ℃/min 的升温速度测定30 ℃到600 ℃的变化。

1.2.11 机械性能测定 使用万能试验机测试膜的拉伸强度（TS）和断裂伸长率（EAB）。根据国标GB/T 1040.3-2006 的试验条件进行测试。制备的膜宽为25 mm，长为115 mm，窄平行部分宽6 mm，长33 mm。测试条件：初始夹距33 mm，测试速度50 mm/min。TS 和EAB 根据以下公式计算：

式中：Fmax为膜断裂时的力（N）；S 为膜的截面面积（mm2）；L 为膜断裂时的最终长度（mm）；L0为膜样品的初始长度（mm）。

1.3 数据处理

每个实验至少重复测定三次，结果用平均值±标准差表示。使用IBM SPSS Statistics 26 软件对数据进行单因素方差分析，使用Tukey 法进行显著性检验，不同字母用以表示显著性差异（P＜0.05）。使用origin 2022 和Adobe Illustrator 2022 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 交联度

经荧光胺法测定，明胶的伯胺基浓度为0.3 mmol/g。根据明胶伯胺基浓度和GAE 环氧值计算，GAEG1、GAEG2、GAEG3中伯胺基与环氧基的摩尔比为1:1、1:2、1:4。经测定得到GAEG1、GAEG2、GAEG3的交联度分别为41.13%、58.47%、72.68%。可以发现随GAE 添加量的增加，GAEG 的交联度逐渐增加。当明胶伯胺基与GAE 环氧基的摩尔比相等时交联度比理论计算值低，这是因为GAE 分子较小，环氧基分布比较密集，空间位阻较大，降低了反应接触面，阻碍了环氧基与伯胺基反应的进行。因此，使用芳香族环氧化物作为明胶改性剂需要使用过量的环氧化物来与明胶反应。

2.2 FTIR 分析

GAE 合成过程的红外光谱如图3 所示。GA在3493 和3272 cm-1处有酚-OH 和芳酸-OH 的特征峰，烯丙基化后两者均消失。同时，烯丙基化没食子酸（Allylated gallic acid，AGA）在3083 cm-1处新出现的峰为烯烃C-H 伸缩振动峰，1587 和987 cm-1处分别是烯烃C=C 伸缩振动吸收峰和C-H 面外弯曲振动吸收峰[23]。第二步环氧化后，上述特征峰减弱或消失，表明双键被反应。GAE 红外光谱中新出现在1250、910、863 cm-1的峰是环氧化物的特征吸收峰，表明GAE 合成成功[24-25]。

图3 GA、AGA 和GAE 的红外光谱Fig.3 FTIR spectra of GA,AGA and GAE

明胶和GAEG 的红外光谱如图4 所示，主要红外特征峰的变化如表2 所示。明胶的红外光谱中显示，3312 cm-1为酰胺A 带是由N-H 伸缩振动产生的；3086 cm-1是酰胺B 带由-CH2伸缩振动引起[9]；1652 cm-1为酰胺I 带代表C=O 伸缩振动/氢键；1558 cm-1为酰胺II 带是由N-H 弯曲振动和C-N 伸缩振动引起的；1246 cm-1为酰胺III 带是由N-H 弯曲振动和C-N 伸缩振动引起的[26-27]。

图4 GAE、明胶和GAEG 的红外光谱Fig.4 FTIR spectra of GAE,gelatin and GAEG

当GAE 改性明胶后，GAE 本身在1250、910、863 cm-1处的环氧基特征峰消失，表明环氧基被反应[28]。环氧基开环产生的醇O-H 和GAE 上的酯基与明胶侧链上的N-H 基和O-H 基之间形成氢键，减小νN-H 和νO-H 的键力常数K，使得GAEG 酰胺A 带和酰胺B 带的峰信号向低波数方向移动。明胶上的伯胺基与环氧基反应变为仲胺基，导致酰胺I 带的峰信号减弱，同时νC=O 形成更多氢键减小了键力常数K，使得峰信号向低波数方向移动。酰胺II 带和酰胺III 带的峰信号也向低波数移动，这是因为随着环氧基与明胶发生化学交联后，形成了C-N 键[29]。综合来看可以确定明胶与GAE 发生了化学交联，在分子内和分子间形成氢键交联。

由明胶和GAEG 酰胺I 带得到的二级结构如表3 所示。经GAE 改性后，GAEG 中β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋均有所下降，β-转角增加，这是由于GAE 与明胶之间形成的共价交联改变了明胶的二级结构。

2.3 XRD 分析

明胶和GAEG 的XRD 光谱如图5 所示。GAE是非晶体结构，在2θ=22°附近具有特征宽峰。2θ=21°左右处显示了明胶具有的非晶态结构特征的宽峰[26]。GAE 改性明胶后，两者的特征宽峰结合增强并向低角度方向偏移，变为17°～15°，说明非晶体结构的有序性增强。这是因为GAE 在明胶分子链间形成共价交联，将明胶分子链连接成更大的结构单元。

2.4 XPS 分析

明胶和GAEG 的XPS 光谱如图6 所示。图6a为明胶和GAEG 的宽扫描光谱，表面元素组成见表4。随着GAEG 的交联度增加，C 元素含量逐渐减少，O 元素逐渐增加，这是因为GAE 分子上O 元素含量较高。与明胶分子上的伯胺基化学交联后提高了O 元素的含量，同时N 元素也有少量的增加，据推测是因为GAE 改性明胶后改变了明胶的分子构象导致内部的氨基暴露。图6b1、图6b2 为明胶的C1s 谱峰，可以拟合为284.80、286.33 和288.17 eV，分别归因于C-C/C-H、C-OH/C-N 和C=O[28]。图6b3、图6b4 为GAEG 的C1s 谱峰，图中显示C-OH/C-N处的峰，随GAEG 交联度的增加而增强。这是因为环氧基与伯胺基反应后开环产生醇-OH 和C-N 键。C=O 处的峰也略微增加，这是因为GAE 分子上具有C=O，随交联反应接枝到明胶分子上。结果分析表明GAE 的环氧基与明胶分子上的伯胺基发生了共价交联反应。

图6 明胶和GAEG 的XPS 光谱Fig.6 The XPS spectra of gelatin and GAEG

表4 明胶和GAEG 的元素组成Table 4 The elemental composition of gelatin and GAEG

2.5 溶胀过程光学图像

明胶和GAEG 在水中浸泡的光学照片如图7a所示。浸入水中7 d 后，明胶膜完全溶解而GAEG膜均可保持完整的形态，表明GAEG 膜较纯明胶膜有更高的耐水性。随着GAEG 交联度的升高，膜的溶胀形态愈加稳定。图7b 为明胶与GAEG 在水中溶胀过程示意图。纯明胶分子链间主要靠氢键和分子间相互作用力形成交联网络，这些相互作用力在水中会断裂或消失，使得明胶分子链逐渐分散在水中，导致交联网络崩解。GAE 与明胶发生反应后，可以在不同明胶分子链间以C-N 共价键形成交联结构。相较于纯明胶膜分子链间的相互作用力，C-N 共价键在水中更为稳定，因此改性明胶膜在水中更容易保持结构。

图7 明胶和GAEG 在水中溶胀的光学照片及示意图Fig.7 Optometric photos and schematic diagram of gelatin and GAEG swelled in water

2.6 溶胀率测定

明胶和GAEG 在水中的溶胀率测试试验结果如图8 所示。明胶在水中10 min 左右基本完成吸水溶胀，溶胀率在1400%左右。而GAEG 在前10 min溶胀速率与明胶基本相近，之后继续快速吸水溶胀，到第7 d 时溶胀率达到最大为纯明胶的5 倍左右。随着GAEG 交联度的增加，溶胀率从7831%减小至6722%、6448%。改性后提高了溶胀率，这是因为GAE 上环氧基与明胶上伯胺基发生开环反应后生成了羟基，提供更多的亲水基团。随着交联度上升，GAE 在明胶分子链间产生了更多的C-N 共价交联，更多的连接位点减小了明胶分子链间的伸展空间，从而降低了溶胀率，这一结果也与XPS 的结论相符合。

图8 明胶和GAEG 的溶胀率Fig.8 Swelling ratio of gelatin and GAEG

明胶由于高亲水性，其膜在水中1 h 以内基本维持溶胀形态，在24 h 内完全崩解。GAEG 膜在水中的崩解速度显著（P＜0.05）下降，GAEG1膜在第30 d时被完全水解，GAEG2膜在第60 d 时被完全水解。这是因为，GAEG 分子间存在C-N 共价键在水中稳定性更高，且随着交联度升高，更多的C-N 键形成了更稳定的共价交联降低了崩解速度。

综合分析可以发现GAE 改性明胶后既提高了明胶的溶胀率又显著改善了明胶材料在水中易崩解的性质。

2.7 水接触角测定

对表面水接触角进行测试，试验结果如图9 所示。图9a 为纯明胶的水接触角为88.01°，图9b～图9d 为GAEG 膜的水接触角，随GAEG 交联度的升高，水接触角逐渐降低，表明材料表面的亲水性增加[30]。这是因为环氧基与伯胺基发生反应后开环产生了羟基，羟基具有较强的亲水性，因此改性后明胶膜更加亲水。

图9 明胶和GAEG 的水接触角Fig.9 Water contact angle of gelatin and GAEG

2.8 脱水率测定

明胶和GAEG 在水中的脱水率测定结果如图10所示。明胶和GAEG 膜在前2 h 干燥中脱水率较大，这是因为此时脱去的水主要为自由水。随着交联度的提高，GAEG 可以脱去的自由水增加，表明改性后持水性增强。2 h 后脱水速率减慢，此时脱去的是内部的结合水。干燥6 h 后，明胶基本恒重，总脱水率在76.98%；GAEG 继续脱水，表明改性后内部的结合水增加，这是因为内部引入了亲水的羟基，可以与更多的水分子缔合，随着交联度的增加，GAEG 最后的总脱水率逐渐提高。

图10 明胶和GAEG 的脱水率Fig.10 Water loss ratio of gelatin and GAEG

2.9 同步热分析

明胶和GAEG 的DSC 曲线如图11 所示。随着交联度的增加，变性温度从纯明胶膜的55.0 ℃分别提高至57.3、59.0、61.7 ℃，表明GAEG 膜的热稳定性提高。明胶和GAEG 膜的TG-DTG 曲线如图12所示。纯明胶膜的初始失重温度比GAEG 膜低，总失重率比GAEG 膜高。纯明胶的第一个最大分解温度在240 ℃左右，交联改性后分别升高至266、269、274 ℃，表明明胶的热稳定性在改性后得到了提高。这种变化是因为GAE 与明胶分子共价交联后形成了新的交联网络，提高材料的交联稳定性。同时，改性明胶分子内和分子间的氢键增加也有利于结构稳定，从而提高热稳定性。

图12 明胶和GAEG 的TG-DTG 热谱图Fig.12 TG-DTG curves of gelatin and GAEG

2.10 机械性能分析

明胶和GAEG 膜的应力应变曲线如图13 所示。与明胶膜相比GAEG1膜的应力降低应变增加。随着GAE 的添加，GAEG2和GAEG3膜的应力和应变均有所下降，表明GAE 降低了明胶膜的机械性能。明胶和GAEG 膜的TS 和EAB 如表5 所示。明胶膜的TS 在GAE 改性后随着交联度增加而降低。明胶膜的EAB 为6.96%，与GAE1:1 改性后提升，但随着GAEG 交联度的继续增加发生了下降。GAE 改性明胶后降低了明胶膜的机械性能，这是因为明胶二级结构中α-螺旋与β-折叠对明胶的力学性能有很大的影响[31-32]，而改性后的明胶二级结构中α-螺旋与β-折叠含量下降，因此降低了其机械性能。

图13 明胶和GAEG 的应力应变曲线Fig.13 Stress-strain curves of gelatin and GAEG

表5 明胶和GAEG 的力学性能Table 5 Mechanical properties of gelatin and GAEG

3 结论

通过环氧化物对明胶化学改性，研究GAE 添加量对明胶的结构和性能的影响。结果表明，GAE 可以与明胶发生化学交联反应并形成C-N 共价键；晶相结构发生显著变化，向小角度偏移并增强；耐水性有显著提高，GAEG 在水中溶胀率提高至7831%，崩解速度显著下降，在水中保持溶胀状态的时间延长至7 d；水接触角从88.01°下降至59.87°，表明亲水性增强；脱水速率减慢，总脱水率增加；热稳定性有所提高，热变性温度从55.0 ℃提高至61.7 ℃，最大热失重温度从240 ℃提高至274℃，热失重率降低。更优良的水合性能和热稳定性意味着GAEG 有希望应用于食品加工中作为保水剂和稳定剂。但在力学性能上的不良表现仍使其应用具有一定的局限性，因此在未来的研究中可以探索复合其他改性剂来改善力学性能。GAE 作为改性剂既可以在明胶分子链间形成共价键提高在水中的稳定性，又可以引入一定数量的羟基提高亲水性，因此具有相当大的研究意义和潜在价值。