广州地区耐多药结核分枝杆菌MIRU-VNTR位点与耐药性变迁的关联研究

刘振宁 刘志辉

广州市胸科医院检验科，广州 510095

据世界卫生组织报道，每年大约1 000万结核病中约有50 万的利福平耐药患者，其中78%对异烟肼也有耐药性，即耐多药结核病［1］。2020 年开始，全球耐多药结核病的患者发病数呈上升趋势，对21 世纪消除结核病的目标构成严峻挑战［2-3］。国外有研究表明，很大比例的结核患者在接受化学药物治疗的过程中产生了耐药性变化［4］，耐多药北京结核菌株与耐药表型之间存在很强的关联性［5］。在耐药结核高发区，大部分耐多药患者通常由几例密切相关的菌株产生耐药性传播引起，约占耐多药结核病例的70%［6-7］。上述结果提示了耐多药结核菌的成簇或许与其耐药性变迁有关联。结核分枝杆菌散在重复单元-数目可变串联重复序列（ycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR）广泛用于结核分枝杆菌的基因分型，基于聚合酶链式反应（PCR），完全相同MIRU-VNTR谱型的结核分枝杆菌分离株可被聚类，以识别具有流行病学联系的病例［8-9］。因此，菌株的耐药性变迁是否可能与特定的VNTR 位点之间有关？为了解决这个问题，我们在此研究了广州市胸科医院Hunter-Gaston 指数（HGDI）大于0.6 的耐多药结核分枝杆菌的16 个MIRU-VNTR 位点数据，现报道如下。

资料与方法

1.试验菌株

从广州市胸科医院菌株库调取2011 至2015 年冻存的36 例患者共105 株耐多药结核菌，其中每例患者含2～8 株耐多药结核菌，以每例患者的第一株菌作为对照，其培养间隔范围在3～1 229 d。菌株的来源：男性患者30 例，年龄范围21～68 岁；女性患者6 例，年龄范围25～39 岁。菌株置于孵育箱37 ℃孵育过夜，接种于7H10 米氏固体培养基（含10% OADC 增菌液）中传代培养，4～6 周后收集菌落备用。我们分析了5 年期间在该数据库中的所有耐多药结核菌培养阳性的临床样本。

本研究已经广州市胸科医院医学伦理委员会审批通过，批准文号：胸医伦理（2019）24号。所有受试对象均知情同意并签署知情同意书。

2.仪器与试剂

琼脂糖凝胶成像系统（型号BIO-RAD Molecular Imager Gel DocTM XR+Imaging system，美国伯乐公司）；PCR 扩增仪（型号BIO-RAD C100TM Thermal cycler，美国伯乐公司）；琼脂糖凝胶电泳仪（型号BIO-RAD Power PacTM Basic，美国伯乐公司）。DNA 染料（SYBR Gold，北京鼎国生物技术有限责任公司）；固体培养基粉末（Middlebroke 7H10，美国BD 公司）；增菌液（BBLTM Middlebrook OADC，美国BD 公司）；液体培养基粉末（Middlebrook 7H9，美国BD 公司）。PCR 扩增试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）。Ezup柱式酵母基因组DNA 提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；琼脂糖（Biowest 111860 Regular AGAROSE G-10，西班牙Biowest公司）。

3.方法

3.1.耐多药结核菌DNA 提取 从105 株耐多药结核菌的传代培养物中提取其基因组DNA，具体操作按上述DNA提取试剂盒说明书进行。

3.2.耐多药结核菌48 位点MIRU-VNTR 基因分型48 个MIRU-VNTR 位点通过各自对应的引物进行PCR 扩增［10］，具体操作按RNA 扩增试剂盒说明书进行，然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并测定每个扩增子的重复单元（等位基因）的长度。对于每个位点，分别使用结核分枝杆菌H37Rv 标准菌株DNA 和去离子水作为阳性和阴性对照。根据已知的研究方法提取耐多药结核菌的DNA，并通过PCR 扩增其目的基因片段［11］，确定重复单元的大小。对于在任一位点出现多条带的菌株，重复PCR以确认结果。

3.3.VNTR 多态性和HGDI 指数的分析 利用48 位点VNTR 最小可重复序列重复次数，通过HGDI 指数计算各位点MIRU-VNTR 法的分辨力［12］。HGDI可作为评价VNTR位点分辨率高低的指标。当HGDI为0.00时，表明所有菌株无法区分，当HGDI为1.00时，表明所有菌株被区分。HGDI指数小于0.3判断为低分辨率，HGDI指数大于0.6判断为高分辨率，HGDI 指数介于0.3～0.6 之间判断为中等分辨率，具体HGDI 计算公式：HGDI=1-∑ nj（nj-1）∕N（N-1）；N 为菌株总数，S 为总类型数，nj 是第j 类型的菌株数［13］。本实验中，我们对HGDI指数大于0.6的16个高分辨率VNTR位点进行研究。

4.药物表型与MIRU-VNTR位点变化的判断标准

本文所用于研究的药物表型有6 种（异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和莫西沙星）。HGDI 指数大于0.6 的高分辨率MIRU-VNTR 位点有16 个：VNTR2401、VNTR0154、VNTR3192、VNTR0595、VNTR2461、VNTR2996、VNTR1305、VNTR2347、VNTR4348、VNTR0960、VNTR1907、VNTR4052、VNTR1895、VNTR2687、VNTR1955和VNTR4155。每位耐多药结核复发患者均具有两株以上的菌株，以各自患者第一株菌株为对照，与自身其他菌株作对比，菌株的药物表型不一致判断为表型有变化，药物表型一致为无变化，菌株的VNTR 位点可重复单元拷贝数不一致判断为该位点有变化，菌株的VNTR 位点可重复单元拷贝数一致判断为该位点无变化。

5.统计分析

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。耐药表型和VNTR位点之间的相关性使用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1.耐多药结核患者的临床资料

在36 例耐多药患者共105 株结核菌中，其中22 例患者（61.1%）发生耐药性变迁（69 株），14 例患者（38.9%）未发生耐药性变迁（36 株）。异烟肼耐药表型变迁的结核菌有4 株（5.8%）：2 株（50.0%）由敏感变耐药；2 株（50.0%）由耐药变敏感。乙胺丁醇耐药表型变迁有18 株（26.1%）：9 株（50.0%）由敏感变耐药；9 株（50.0%）由耐药变敏感。链霉素耐药表型变迁有8 株（11.6%）：7 株（87.5%）由敏感变耐药；1 株（12.5%）由耐药变敏感。阿米卡星耐药表型变迁有8 株（11.6%）：7 株（87.5%）由敏感变耐药，1 株（12.5%）由耐药变敏感。左氧氟沙星耐药表型变迁有21 株（30.4%）：13 株（61.9%）由敏感变耐药，8 株（38.1%）由耐药变敏感。莫西沙星耐药表型变迁有25株（36.2%）：16株（64.0%）由敏感变耐药，9株（36.0%）由耐药变敏感。

2.耐药表型与MIRU-VNTR位点的关联性

本研究采用χ2检验分析耐药表型与MIRU-VNTR 位点的关联性。耐药表型有变化组里，VNTR 位点有变化数为130 个，VNTR 位点无变化数为190 个；耐药表型无变化组里，VNTR 位点有变化数为88 个，VNTR 位点无变化数为168 个；合计共576 个位点。耐药表型与MIRU-VNTR 位点无显著的关联性（χ2=2.36；P＞0.05）。

3.耐药表型变化种数与MIRU-VNTR 位点的关联性（表1）

表1 耐多药患者的耐药表型变化种数与MIRU-VNTR位点之间的关联性

本研究共有6 种耐药表型（异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、左氧氟沙星和莫西沙星）产生变化，将所有患者的每株耐多药结核菌根据表型的变化种类数分为5 个实验组，分别为耐药表型无变化、1 种药物变化、2 种药物变化、3 种药物变化和4 种药物变化，1 种药物变化指上述6 种药物中任意1 种发生变化，以此类推，其中，耐药表型无变化组-4种药物变化组与VNTR 位点有显著的关联性（χ2=4.48；P＜0.05）。

4.耐药表型的变化与高分辨率MIRU-VNTR 位点的关联性（表2）

表2 6种抗结核药物耐药表型变化与16个MIRU-VNTR位点变化情况

将6 种耐药变化的表型分别与16 个高分辨率MIRU-VNTR 位点进行χ2检验，结果显示，乙胺丁醇耐药表型与VNTR4348 位点（χ2=4.48，P＜0.05）、链霉素耐药表型与VNTR0595 位点（χ2=4.76，P＜0.05）、莫西沙星耐药表型与VNTR1907位点（χ2=5.08，P＜0.05）以及莫西沙星耐药表型与VNTR1895 位点（χ2=4.72，P＜0.05）具有显著的关联性，其余组合的变化差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

讨论

耐多药结核病是全球主要的公共卫生问题，颠覆了结核病控制所取得的成就［14-15］。未来几十年内，高负担国家的耐多药结核患者人数预计将持续增加［16］。尽管涉及耐多药结核病传播的流行病学因素已为人所知，但其耐药性变迁与VNTR 位点之间的关系查阅文献尚未见报道。而目前VNTR分型技术的相关研究基本集中在聚类分析，引起其重复单元拷贝数变化的影响因素还未明确。本项目通过耐药表型和VNTR 分型技术，探讨耐多药患者的菌株在耐药表型和VNTR 方面的关联性。结果表明，某些耐药表型和MIRU-VNTR 位点存在显著关联，为其具体机制提供了研究基础。

当病菌进入休眠状态并停止大多数的代谢活动时，增加了病菌对抗生素的耐受性，避免药物对复制状态中的细菌造成致命性影响，这种现象被定义为表型耐药［17-18］。与基因突变和获得性耐药不同，结核菌的表型耐药只与代谢或生理活性的降低有关［19-20］。我们的研究结果显示，耐多药结核菌株的表型耐药增加到4种时，与VNTR 位点有显著关联性，或许耐药表型的种类增加到一定数量以上时，对VNTR位点的改变才会明显增强。据报道，从复发或潜伏性结核病患者中分离出的耐药表型菌株对一线结核病药物如异烟肼、利福平和乙胺丁醇的耐药性比其他患者更高［19］，但具体机制尚未明确。近年来，由于基因组学的进步，人们对结核菌耐药机制的认识逐渐加深。然而，尽管取得了实质性进展，但仍存在进一步阐明表型耐药分子基础的空间。

MIRU-VNTR 基因分型的重复单元数量可以根据整个位点扩增产生的片段大小来确定。每株分离菌通过各自重复单元集的拷贝数进行分型，以此判断结核菌是否产生改变。随着MIRU-VNTR 的可用重复单元的种类逐渐被发掘，其分型菌株的能力也会更强［21］，这样更容易发现菌株是否发生了改变。国外有研究报道，希腊流行结核菌株的基因型与耐药性之间无明显关联［22］，上述结果与我们的研究相符合。最近伊朗方面通过MIRU-VNTR 基因分型技术分析出该地区的耐多药结核菌成簇数增加［23］，我们则进一步从统计学角度出发，验证了耐多药结核菌株的耐药种类及其表型与遗传基因的多样性存在显著关联，发生表型变迁（敏感变耐药、耐药变敏感）的耐多药结核菌中，异烟肼和乙胺丁醇均分别为50.0%、50.0%，链霉素和阿米卡星均分别为87.5%、12.5%，左氧氟沙星分别为61.9%、38.1%，莫西沙星分别为64.0%、36.0%。长期用药会导致处于休眠状态下少数耐药结核菌存活的现象发生，当其生长恢复时，将重新建立对药物的敏感性，产生新的传播链。因此，我们猜测是结核分枝杆菌复合群由于化学性药物的长期抑制或再感染而造成的耐药性变迁。国内研究表明，中国南方地区211 例结核分枝杆菌临床分离株的48 位点MIRU-VNTR 基因分型除了18 个VNTR 位点扩增不出、14 个位点属于中低分辨率外，其余16 个VNTR 位点均为高分辨率，且16 位点组合的分辨率高达0.98［24］。我们在此基础上，对16 个高分辨率的VNTR位点，进一步研究表型耐药与MIRU-VNTR 位点是否存在关联。结果表明：异烟肼、阿米卡星和左氧氟沙星的耐药表型菌株与16个高分辨率VNTR 位点均无显著关联，而乙胺丁醇、链霉素和莫西沙星的耐药表型菌株则具有显著关联性，说明部分耐药表型菌株的变化可能由多种基因型的菌株造成，来自部分结核高负担区域的人口迁移不断增加。

总之，耐多药结核分枝杆菌的耐药变迁与其遗传的多态性存在明显关联，如果增加各病例的流行病学相关数据，就能够进一步验证是否与特定的高负担地区有关，从而明确防治目标。但本研究存在不足之处，如样本来源不够广泛、样本量较少、缺乏相关的流行区域资料以及其他表型耐药菌株，还需继续对耐药变迁与VNTR 位点的多态性进行深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明刘振宁：实验设计、实行研究、数据分析和文章撰写；刘志辉：项目管理、课题指导和写作指导