不同品种石榴汁中没食子酸含量测定及其抗氧化能力比较

唐大为 罗凯文 张梦晓 刘浩

摘 要：研究以红玛瑙、白玉籽2个石榴品种为材料，采用高效液相色谱法（HPLC）和福林酚法分別测定了石榴汁中没食子酸和总多酚的含量，并采用ABTS快速法和FRAP法综合评价了2种石榴汁的抗氧化能力，以期更加深入地了解石榴的营养价值和应用潜力，同时为筛选优质石榴品种提供参考。结果表明：在试验条件下，没食子酸在3.125～50 μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，红玛瑙和白玉籽石榴汁中没食子酸的含量分别为7.49和24.56 μg/mL；总多酚含量在0～1 000 μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，红玛瑙和白玉籽石榴汁中总多酚的含量分别为287.6 和737.6 μg/mL；当总多酚含量为0～200 μg/mL时，2种石榴汁的总抗氧化能力均随着总多酚浓度的增加而增强；白玉籽石榴汁中没食子酸和总多酚的含量均高于红玛瑙石榴汁，故其总抗氧化能力也强于红玛瑙石榴汁。

关键词：石榴；没食子酸；高效液相色谱法；总多酚；抗氧化活性

中图分类号：TS201.4  文献标识码：A文章编号：1006-060X（2023）10-0074-05

Determination of Gallic Acid Content in Fruit Juice of Different Pomegranate Varieties and Comparison of Their Antioxidant Capacity

TANG Da-wei， LUO Kai-wen， ZHANG Meng-xiao， LIU Hao

（School of Pharmacy， Bengbu Medical College， Anhui Engineering Technology Research Center of Biochemical Pharmaceutical， Bengbu 233000， PRC）

Abstract：This paper aims to further explore the nutritional value and application potential of pomegranate （Punica granatum）， and provide reference for screening quality varieties. Using two pomegranate varieties 'Red Agate' （Hongmanao） and 'White Nephrite Bead' （Baiyuzi） as materials， gallic acid and total polyphenol contents in fruit juice were determined by the high performance liquid chromatography （HPLC） and Folin-Ciocalteu method. The antioxidant capacity of fruit juice was assayed by the ABTS method and FRAP method. Results showed that the gallic acid content showed a good linear relationship between 3.125-50 μg/mL under experiment conditions， reaching 7.49 μg/mL in 'Red Agate' and 24.56 μg/mL in 'White Nephrite Bead'. The total polyphenols showed a good linear relationship between 0-1 000 μg/mL， reaching 287.6 μg/mL in 'Red Agate' and 737.6 μg/ml in 'White Nephrite Bead'. In the range of 0-200 μg/mL of total polyphenols contents， the total antioxidant capacity of the two pomegranate juices increased with the increase of total polyphenols concentration. 'White Nephrite Bead' pomegranate juice were higher than 'Red Agate' in the contents of gallic acid and total polyphenols， so had a stronger antioxidant capacity.

Key words：pomegranate （Punica granatum）; gallic acid; high performance liquid chromatography; total polyphenols; antioxidation activity

收稿日期：2023–05–05

基金项目：安徽省优秀科研创新团队项目（2022AH010084）；安徽省学术和技术带头人后备人选科研活动经费资助项目（2019）；蚌埠市联合攻关项目（BYLK201801）；安徽省生化工程中心科研平台开放课题（2023SYKFD06）

作者简介：唐大为（2001—），男，安徽芜湖市人，本科生，药学专业。

通信作者：刘 浩

石榴（Punica granatum L.）为千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica）的落叶灌木或小乔木，别名安石榴、山力叶等。在我国，石榴具有悠久的栽培历史，且具有产量充足、品种丰富等优点。怀远石榴为安徽省怀远县特产，同时也是国家地理标志产品，其中以红玛瑙、白玉籽2种石榴品种为典型代表。

石榴汁富含可溶性多酚，具有显著的抗高血压作用[1]。与此同时，日常饮用石榴汁可以起到对心血管的保护作用，降低冠心病发生的风险[2]。石榴多酚提取物作为一种天然的抗氧化剂和抑菌剂，具有抗氧化作用强、抑菌时间长、不易引起耐药性等特征，可充分应用于改善氧化应激状态和细菌感染类疾病的辅助治疗[3]。研究表明，石榴多酚除具备抗氧化、抑菌的功效之外，还在预防动脉粥样硬化、心血管疾病以及抗肿瘤、抗病毒等领域有着积极的作用[4]。

目前，常用的多酚类化合物检测方法为福林酚法[5]，该方法可有效检测石榴汁提取物中总多酚的含量，且该方法兼具操作简便、准确性好、适用性强等特点。没食子酸是石榴提取物中多酚类化合物的主要成分之一，具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抑菌[8]、保护中枢神经系统[9]等功效。采用高效液相色谱法（HPLC）可将没食子酸与其他多酚类成分进行有效分离，从而确定石榴汁中没食子酸的含量。

石榴汁的抗氧化活性可通过总抗氧化能力来评价[10]，常采用ABTS快速法[11]和FRAP法[12]综合测定石榴汁的总抗氧化能力，这2种方法分别以Trolox和FeSO4为阳性对照[13-15]，其结果具有一定的客观性。总多酚为石榴汁中起主要抗氧化作用的成分，没食子酸则为总多酚中最能代表抗氧化活性的成分。因此，该研究以红玛瑙和白玉籽2个石榴品种为材料，测定了石榴汁中没食子酸和总多酚的含量，并采用ABTS快速法[11]和FRAP法综合评价了2种石榴汁的抗氧化能力，以期更加深入地了解石榴的营养价值和应用潜力，同时为筛选优质石榴品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试石榴品种为安徽怀远红玛瑙、白玉籽石榴，均购自安徽省蚌埠市水果批发市场。主要试剂有没食子酸对照品（纯度≥98%）；甲醇、三氟乙酸（TFA）作为流动相为色谱纯；乙酸乙酯、福林酚、Na2CO3等其余试剂均为分析纯；所用水为超纯水；另外还有碧云天总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法和FRAP法）。

主要仪器设备有万分之一电子天平、LNG-96型真空离心浓缩仪、LC-16型岛津高效液相色谱仪、UV-2700型紫外分光光度计、M22R-MB-8型低温冷冻离心机、Synergy-HT型酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 沒食子酸含量的测定 （1）色谱条件。色谱柱为 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35℃；流动相采用二元体系，A为甲醇，B为TFA（0.1%），梯度洗脱条件[16]：0～10 min，B 98%～87%； 10 ～15 min，B 87% ；流速 1.0 mL/min；进样量10 μL；没食子酸检测波长 为254 nm[17]。（2）对照品溶液制备。精密称定10 mg没食子酸标准品于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解定容制得1 mg/mL的没食子酸标准品母液。采用等比稀释法，依次制成浓度为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的系列对照品溶液备用。（3）标准曲线绘制。以系列对照品溶液进行测定，以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。（4）供试品溶液制备及测定。 新鲜石榴去皮剥籽，将种粒与果肉分离，手动榨汁并收集，5 000 r/min离心5 min沉淀悬浮物；取上清液2 mL于离心管中，再次以8 000 r/min离心，取上层石榴汁0.5 mL转移至新的离心管中；用0.5 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经真空离心浓缩仪浓缩蒸干后，加入0.5 mL的甲醇复溶，12 500 r/min离心5 min，取上层液在254 nm下测定没食子酸含量。每种石榴随机选取6个样品按上述方法制备供试品溶液，采用外标法对供试品中的没食子酸进行定量，分别计算2种石榴中没食子酸含量的平均值。

1.2.2 方法学验证 （1）精密度试验。 随机选取一供试品溶液，连续进样6次，每次进样量均为10 μL，测定没食子酸的峰面积。（2）稳定性试验。随机选取一供试品溶液，分别在制备完成0、3、6、9、12、15 h进样，每次进样量均为10 μL，测定没食子酸的峰面积。（3）重复性试验。采用供试品溶液的制备方法，另外制备6个样品进行平行试验，色谱条件相同，每次进样量均为10 μL，测定没食子酸的峰面积。（4）加标回收率。选取9份已知没食子酸含量的1 mL供试品，分成3组（3份为一组），分别加入浓度为原样品中没食子酸含量50%、100%、150%的对照品溶液1 mL [18]，按照1.2.1种的方法进行测定，计算加标回收率。

1.2.3 总多酚含量测定 参考Tarantino等[19]的方法，采用福林酚法测定石榴汁中总多酚含量。取250 μL果汁，加入19.5 mL双蒸水和1.25 mL福林酚试剂中；3 min后，加入3.75 mL质量分数为 2%的Na2CO3溶液，室温下避光反应2 h；使用紫外分光光度计测定溶液在760 nm处的吸光度；以没食子酸标准品为对照，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线，采用外标法进行定量。

1.2.4 总抗氧化能力评价 （1）ABTS快速法。 2种石榴分别随机选取6个样品，按照1.2.3中的方法测定各石榴汁样品的总多酚含量，根据测得的总多酚含量分别将样品中的总多酚含量用蒸馏水分别稀释成20、40、60、80、160、200 μg/mL，按ABTS快速法使用酶标仪测定其在405 nm下的吸光度，石榴汁的总抗氧化能力以达到同样吸光度所需的Trolox溶液的毫摩尔数表示。以ΔA405（即A405空白对照－A405标准品）为纵坐标，不同浓度的Trolox溶液为横坐标绘制标准曲线，代入各样品的ΔA405计算其总抗氧化能力，结果取平均值。（2）FRAP法。2种石榴分别随机选取6个样品，按照1.2.3中的方法测得各石榴汁样品的总多酚含量，根据测得的总多酚含量分别将样品中的总多酚含量用蒸馏水分别稀释成10、20、40、60、80、100 μg/mL，按FRAP法使用酶标仪测定其在593 nm下的吸光度，石榴汁的总抗氧化能力以达到同样吸光度所需的FeSO4溶液的毫摩尔数表示。以吸光度为纵坐标，不同浓度的FeSO4溶液为横坐标绘制标准曲线，代入各样品的A593计算总抗氧化能力，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 方法学验证结果

试验结果表明，没食子酸含量测定的标准方程为y=18 075x－25 601，R2=0.999 4，在3.125～50 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。精密度试验结果表明，6次测定的峰面积RSD为1.32%，表明该方法精密度良好。稳定性试验结果表明，样品放置0～15 h后测得的峰面积RSD为2.48%，表明供试品溶液在配置15 h内稳定性良好。重复性试验结果表明，6个样品平行测定后峰面积RSD为1.05%，表明该方法具有较好的重复性。加标回收率试验结果（表1）表明，样品在加标量为50%、100%、150%时的回收率RSD分别为2.87%、1.81%、1.79%，表明在不同浓度水平下，该方法的加标回收率是合格的。综上所述，各项方法学的考察结果均符合要求，表明该方法可用于测定石榴汁中没食子酸的含量。

2.2 2种石榴中没食子酸含量的测定结果

按照1.2.1的方法进行测定，对照品及样品的色谱图如图1所示，没食子酸与其他共存峰得到较好的分离。经测定，红玛瑙石榴汁中没食子酸的含量为7.49 μg/mL，白玉籽石榴汁中没食子酸含量为24.56 μg/mL（表2）。

2.3 總多酚含量测定结果

按照1.2.3的方法测定石榴汁中的总多酚含量，标准方程为y=0.000 5x－0.010 8，R2=0.997 9，在0～1 000 μg/mL 的浓度范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系。经测定，红玛瑙石榴汁中总多酚含量为287.6 μg/mL，白玉籽石榴汁中总多酚含量为737.6 μg/mL（表2）。

2.4 总抗氧化能力测定结果

2.4.1 ABTS快速法 采用ABTS快速法测定石榴汁的总抗氧化能力，如图2所示，在0～200 μg/mL的范围内，随着总多酚浓度的增加，2种石榴汁的总抗氧化能力均增强，石榴汁的总抗氧化能力与总多酚的浓度具有明显的相关性，白玉籽石榴汁的总抗氧化能力略强于红玛瑙石榴汁。

2.4.2 FRAP法 采用FRAP法测定石榴汁的总抗氧化能力，结果如图3所示，在0～100 μg/mL的范围内，随着总多酚浓度的增加，2种石榴汁的总抗氧化能力均增强，石榴汁的总抗氧化能力与总多酚的浓度具有明显的相关性，白玉籽石榴汁的总抗氧化能力略强于红玛瑙石榴汁。

3 讨论与结论

研究测定了红玛瑙和白玉籽2个石榴品种的没食子酸、总多酚含量，结果表明，白玉籽石榴汁中没食子酸的平均含量高于红玛瑙，约为红玛瑙石榴汁中没食子酸含量的3.3倍。同时，白玉籽石榴汁中总多酚含量也高于红玛瑙，约是红玛瑙石榴汁中总多酚含量的2.6倍。采用ABTS快速法和FRAP测定石榴汁的总抗氧化能力，结果表明，在总多酚浓度相同的情况下，白玉籽石榴汁的总抗氧化能力

略强于红玛瑙，且在总多酚含量0～200 μg/mL的范围内，2种石榴汁的总抗氧化能力与其总多酚含量呈现明显的相关性。由此推测，石榴汁的抗氧化活性与其没食子酸及总多酚的含量密切相关，白玉籽石榴汁的没食子酸与总多酚含量均高于红玛瑙，其抗氧化活性与红玛瑙石榴汁相比也更强。

石榴是一种常见水果，石榴汁提取物兼具食用价值与药用价值[20-22]。研究采取石榴汁中的没食子酸这一成分作为切入点，重点讨论石榴汁的抗氧化活性。通过对有效成分含量的测定以及体外抗氧化能力的综合比较，更加充分、深入地了解了石榴的营养价值和开发应用潜力，为筛选优质石榴品种提供了一定的科学依据。

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（责任编辑：成 平）