汉族人群Toll样受体3基因启动子区rs128912单核苷酸多态性与白内障的关系

郭晶晶,马玲玲,江 黎,周妍妍,陈伟芳,贺 玲

0 引言

白内障是世界范围内的第一致盲原因,也是造成视力损害的主要原因[1]。由于我国人口呈不断老龄化趋势,预防年龄相关性白内障的增加以及延缓早中期白内障的进展成为现阶段的重难点问题[2]。超声乳化手术是目前临床上治疗白内障的主要方法,但术后仍可出现并发症,同时白内障手术的需求也在增加,给患者家庭及社会造成了沉重的经济负担[3]。白内障的发生与外伤、辐射、衰老等多种因素密切相关[4]。此外,遗传因素在白内障的发生发展中亦起着至关重要的作用[5]。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是人类早期病原体识别和宿主防御系统的重要组成部分,在保护细胞免受损伤和介导组织稳态方面起着重要作用[6]。TLR3是TLRs家族的重要成员,在炎症反应急性期作为损伤相关分子模式和组织坏死的内源性受体[7]。此外,TLR3也是识别病毒病原体相关分子模式的关键受体[8]。研究表明,TLR3基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与黄斑变性有关[9],但TLR3基因启动子区SNP与白内障的关系尚未阐明。本研究选择TLR3基因启动子区SNP进行研究,对汉族人群TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与白内障的关系进行分析,报道如下。

1 对象和方法

1.1对象选取2019-06/2021-06我院收治的白内障患者263例作为研究组,其中男148例,女115例;年龄51～76(平均64.19±5.86)岁。纳入标准:(1)符合2016年美国眼科学会制定的白内障诊断标准[10],术后病理组织活检确诊为白内障;(2)均为汉族人群,四代内不存在血缘关系。排除标准:(1)合并青光眼、葡萄膜炎及外伤等其他原因引起的并发性白内障者;(2)合并糖尿病、肾病等全身性疾病者。另选取同期我院收治的晶状体脱位患者150例作为对照组,其中男86例,女64例;年龄51～78(平均63.57±5.42)岁。纳入标准:均为汉族人群,四代内不存在血缘关系。排除标准:合并其他眼部疾病。两组患者性别构成、年龄比较,差异均无统计学意义(χ2=0.044,P=0.834;t=1.062,P=0.289)。本研究严格遵守《赫尔辛基宣言》,并经医院伦理委员会批准。在患者知情同意的前提下,采集其空腹外周静脉血,并在手术时收集晶状体前囊膜组织,用于后续试验。

1.2方法

1.2.1免疫印迹法(Westernblotting)检测TLR3蛋白表达水平取两组患者新鲜冷冻的前囊膜组织,加入RIPA裂解液(上海康朗生物科技有限公司),并于冰上彻底匀浆,振荡混匀,冰浴30min,12000r/min离心5min,收集上清液,得到总蛋白溶液,采用BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离总蛋白,并转移至PVDF膜上,使用TLR3一抗[稀释比例1∶1000,艾博抗(上海)贸易有限公司]4℃孵育过夜,使用二抗[稀释比例1∶5000,艾博抗(上海)贸易有限公司]室温孵育1h,采用Bio-Rad凝胶成像系统对蛋白条带进行检测,使用Image Lab软件计算蛋白条带灰度值,并分析目的蛋白的相对表达水平。

1.2.2TLR3基因启动子区rs128912位点多态性分析采用直接测序法分析TLR3基因启动子区rs128912位点多态性。抽取两组患者空腹外周静脉血5mL,立刻置于EDTA抗凝管中,离心15min,分离中间层外周血白细胞。采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,采用紫外分光光度计测定样品DNA浓度和纯度(A260/A280为1.7～2.0),将合格的样品保存于-20℃冰箱中。使用Primer Premier 5软件设计TLR3基因启动子区rs128912位点引物,上游引物:5’-TCGATCCGATGTAGATGCT-3’,下游引物:5’-ACGTGTAGTCGATGTCGTA-3’,产物大小188bp,通过琼脂糖凝胶电泳进行引物验证,若凝胶电泳图中上面的条带与目的条带大小一致,提示引物特异性高。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)进行扩增,PCR体系(20μL):2.0μL DNA模板、10.0μL 2×MIX、0.4μL 上游引物、0.4μL下游引物和7.2μL ddH2O。PCR程序:95℃ 120s;94℃ 30s,57℃ 90s,72℃ 60s,35个循环;72℃ 10min。采用琼脂糖凝胶电泳检测基因片段的扩增情况。取纯化产物直接进行测序。

1.2.3实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR,RT-qPCR)检测TLR3mRNA表达水平采用Trizol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取外周血白细胞总RNA,并采用逆转录试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)逆转录得到cDNA。以GAPDH为内参,检测目的基因TLR3的表达情况,加入2×SYBR qPCR Master Mix,检测各样品荧光信号,计算TLR3和GAPDH的Ct值,采用2-△△CT法计算目的基因表达情况,实验重复3次,取平均值。TLR3基因上游引物:5’-ACGATCGATCGTAGTGTAGC-3’,下游引物:5’-ACGTAGCTGACTACGATCGT-3’,产物大小156bp;GAPDH基因上游引物:5’-ATTGCTAGGATCGTTTACCA-3’,下游引物:5’-TGTAGTCGTAGTCGTGTAGT-3’,产物大小129bp。

2 结果

2.1两组患者前囊膜组织中TLR3蛋白相对表达水平Western blotting检测结果显示,研究组患者前囊膜组织中TLR3蛋白相对表达水平(4.91±0.56)显著高于对照组(1.75±0.38),差异有统计学意义(t=61.263,P<0.05),见图1。

图1 两组患者前囊膜组织中TLR3蛋白表达水平比较

表1 两组患者TLR3基因启动子区rs128912位点基因型和等位基因频率比较 n(%)

2.3两组患者TLR3mRNA相对表达水平RT-qPCR检测结果显示,研究组中TLR3基因启动子区rs128912位点TT基因型患者外周血TLR3 mRNA相对表达水平显著高于AA和AT基因型患者,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组中不同基因型患者TLR3 mRNA相对表达水平比较

3 讨论

白内障是全世界导致失明的常见原因之一,随着人口老龄化加剧,白内障的发病率不断增加[11]。我国中南部是白内障发病率最高的地区,可能与该地区人群长期暴露在较高的紫外线辐射中有关,预计到2050年,我国白内障患病人数将达到2.41亿[12]。因此,白内障患者的管理是一项重大的公共卫生问题。流行病学研究表明,紫外线辐射、电离辐射、吸烟、衰老等是白内障发生的危险因素[13]。近年研究证实,异常基因表达与白内障的发生密切相关,可导致晶状体中各种蛋白的转录和翻译出现改变,从而破坏晶状体的结构和功能,最终导致白内障的发生[14]。据报道,基因多态性与白内障的发病风险有关[15]。深入研究基因SNP与白内障的关系,有助于从分子水平阐明白内障的发生机制。

TLRs是一种重要的天然免疫受体,可识别外部病原微生物表面的病原体相关分子模式[16]。TLRs可通过与特定的配体结合介导信号转导,从而激活TLRs信号通路,最终促进宿主细胞释放促炎细胞因子,参与炎症反应过程[17]。目前,在哺乳动物基因组已发现13种TLR基因(TLR1～13),其中TLR3基因位于4号染色体q35区,长度为3 029bp,包含5个外显子,共编码504个氨基酸[18]。TLR3属于Ⅰ型跨膜蛋白,由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域组成[19]。年龄相关性黄斑变性是一种由多种因素所致的复杂疾病,也是老年人群常见的退行性疾病,由遗传和环境因素共同引起,天然免疫在年龄相关性黄斑变性发病机制中发挥着关键作用[20]。既往研究表明,湿性年龄相关性黄斑变性患者外周血TLR3 mRNA和蛋白表达水平明显高于正常对照组,TLR3表达上调可能与湿性年龄相关性黄斑变性发病有关[21]。TLR3基因rs3775291多态性能够通过抑制双链RNA诱导视网膜色素上皮细胞死亡,具有潜在的临床意义[22]。此外,TLR3在人脉络膜新生血管形成过程中表达上调[23]。上述研究结果均提示TLR3可能在眼科疾病中发挥重要作用。本研究结果显示,研究组患者前囊膜组织中TLR3蛋白表达水平显著高于对照组,表明TLR3可能在汉族人群白内障发生发展中发挥一定作用。Xie等[24]通过细胞实验发现,TLR3可能是通过靶向Jagged-1/Notch信号通路在白内障发病中发挥作用。本研究分析TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与白内障的关系,结果显示,研究组和对照组患者TLR3基因启动子区rs128912位点AA、AT、TT基因型频率和A、T等位基因频率比较,差异均具有统计学意义,且研究组TT基因型频率及T等位基因频率显著高于对照组,提示携带TT基因型和T等位基因可能增加汉族人群白内障的患病风险。此外,本研究通过检测不同基因型患者外周血TLR3 mRNA表达情况发现,研究组中TT基因型患者TLR3 mRNA相对表达水平显著高于AA和AT基因型患者,表明TLR3基因启动子区rs128912位点多态性可能与TLR3 mRNA表达有关。分析TLR3基因启动子区rs128912位点A突变为T,可能影响TLR3 mRNA表达,进而影响其编码蛋白的功能。但国内尚无学者发现TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与白内障的关联,目前缺乏同类研究。本研究创新之处在于发现了TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与白内障发生的关系,通过检测TLR3基因启动子区rs128912位点多态性有助于早期筛查白内障患者,从而为临床防控提供参考依据。但以上结论缺乏较大样本的流行病学研究,且基因与基因以及基因与环境之间存在相互作用,而本研究仅选择了TLR3基因单个SNP位点进行分析,TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与白内障的关系有待进一步探究。

综上所述,本研究表明,白内障患者晶状体前囊膜组织中TLR3蛋白表达明显上调,且TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与汉族人群白内障易感性有关,携带TT基因型者更易发生白内障,有助于指导临床筛查白内障高风险人群。