基于网络药理学的青蒿治疗肾阴虚型糖皮质激素性骨质疏松机制研究

赖立勇，夏天爽，岳小强，辛海量 （1.海军军医大学：a.药学院生药学教研室；b.中医系, 上海 00433；.海军军医大学第二附属医院中医科, 上海 00003）

作者通过网络药理学和体外实验，对青蒿治疗肾阴虚型糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）的潜在作用靶点及相关信号通路进行预测和初步验证。研究结果表明，青蒿治疗肾阴虚型GIOP 具有多靶点-多通路的特点，可以通过多条途径促进成骨细胞的增殖、分化，其中PI3K/AKT 信号通路是一条重要的通路，青蒿治疗肾阴虚型骨质疏松可能与其能够促进PI3K/AKT 信号通路，促进AKT 的磷酸化有关。

前言

骨质疏松症（osteoporosis, OP）是一种以骨密度（bone mineral density, BMD) 降低、骨量丢失、骨微结构破坏为主要特点的全身代谢性骨病，以骨脆性增加、易发生骨折为主要特征[1]。随着老龄化的加剧，OP 的发生率越来越高，在我国50 岁以上的人群中，OP 的发生率为19.2%，其中女性为32.1%，男性为6.0%[2]。OP 可分为原发性OP 和继发性OP，在继发性OP 中，糖皮质激素性OP（glucocorticoidinduced osteoporosis, GIOP）的发生率排在第一位[3]，目前骨质疏松症（OP）是一种以骨密度（BMD) 降低、骨量丢失、骨微结构破坏为主要特点的全身代谢性骨病，以骨脆性增加、易发生骨折为主要特征[1]。随着老龄化的加剧，OP 的发生率越来越高，在我国50 岁以上的人群中，OP 的发生率为19.2%，其中女性为32.1%，男性为6.0%[2]。OP 可分为原发性OP 和继发性OP，在继发性OP 中，GIOP 的发生率排在第一位[3]，GIOP 治疗上西医使用的药物有钙制剂、活性维生素 D、双磷酸盐类以及雌激素等，这些药物不仅忽略了糖皮质激素这个罪魁祸首，还有可能产生一系列的副作用[4]，寻找安全有效且有针对性的药物显得尤为重要。

中医认为糖皮质激素是“纯阳”之品[5]，使用过量易伤阴津；肾主骨，肾虚是导致骨质疏松的关键病机，因此，肾阴虚证是GIOP 的一个主要证型，临床研究也证明，肾阴虚证是GIOP 患者的一个易患证型[6]。青蒿为菊科蒿属植物黄花蒿植物Artemisia annuaL.的干燥地上部分，分布遍及全国，味苦、辛，性寒，归肝、胆经，具有清虚热、除骨蒸的作用[7]，对于过量使用糖皮质激素造成的阴虚火旺、烦躁不安，有一定的疗效，临床上也常用青蒿加减处方治疗糖皮质激素使用过度，造成阴虚火旺、虚火上炎的病症[8-9]，同时，体内实验发现，青蒿在多种骨丢失模型动物上，可以促进骨组织的再生，提高骨密度[10]，青蒿在治疗骨质疏松方面具有广阔的应用前景。然而，目前关于青蒿治疗OP，特别是在GIOP 方面的研究尚有限，为此，本研究应用网络药理学和体外实验，结合中医基础理论知识，研究青蒿治疗肾阴虚型GIOP 的关键靶点和信号通路，以期明确中药青蒿抗肾阴虚型GIOP 的作用及机制，为骨质疏松的临床治疗提供新思路和方法。

1 材料与方法

1.1 GIOP 相关靶点筛选

在GeneCards 数据库（https://www.Genecards.org）、OMIM 数 据 库（https://omim.org）和Drugbank 数 据 库（https://go.drugbank.com） 中，以“glucocorticoid induced osteoporosis”作为关键词进行检索，获得GIOP 的靶点基因，去除两个数据库的重复结果，获得GIOP 疾病靶点基因。

1.2 肾阴虚相关靶点筛选

根据全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会[11]1986 年对虚证辩证标准的修订，阴虚证诊断标准：主证：①五心烦热（palms and soles）；②咽燥口干（dry throat and thirst ）；③舌红或少苔、无苔（red tongue or less fur or without fur）；④脉细数（thin and rapid pulse）。次证：①午后升火（tidal fever）；②便结而尿短赤（constipation and scanty dark urine）；③盗汗（night sweating）。诊断条件：具备主证3 项，次证1 项。在GeneCards 数据库中，对各症状关键词进行检索，筛选出4 个主证检索结果中至少出现3 次的靶点，与次证检索结果交叉分析后得到阴虚靶点。肾虚证诊断标准为：①腰脊酸痛（soreness and weakness of waist）；②胫酸膝软或足跟痛（soreness and weakness of knees or heel pain）；③耳鸣或耳聋（tinnitus or deaf）；④发脱或齿摇（alopecia or toothmobilit）y；⑤尿后有余沥或失禁（urinary incontinence or poor urination）；⑥性功能减退、不育、不孕（sexual dysfunction and infertility or sterility）。诊断条件：具备3 项。在GeneCards 数据库中，对各症状关键词进行检索，筛选出至少出现3 次的靶点为肾虚靶点。将阴虚靶点与肾虚靶点交叉分析后获得肾阴虚靶点。将GIOP 疾病靶点与肾阴虚靶点交叉分析后获得肾阴虚型GIOP靶点。

1.3 青蒿化学成分筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP：http://tcmspw.com/tcmsp.php）上，以Herb：青蒿、OB≥30%、DL≥0.18 为条件进行检索，确定青蒿的活性成分。

1.4 预测靶点并添加基因名

利用TCMSP 的靶点预测模型，进一步预测青蒿活性成分的相关靶点，通过UniProt 数据库（http://www.Uniprot.org/）对预测靶点添加基因名。最后利用微生信在线软件（http://www.bioinformatics.com.cn/）将肾阴虚型GIOP 靶点基因与青蒿靶点基因进行交集分析，并绘制出韦恩图。

1.5 构建基因蛋白互作（PPI）网络及拓扑分析

将“青蒿-肾阴虚型GIOP”共同靶点基因数据导入String 在线软件（https://string-db.org /），选择种属为“Homo sapiens”，设置最小互作得分为0.4，构建出PPI 网络，将数据导入Cytoscape 软件中进行可视化分析，并利用CytoNCA 插件进行拓扑分析，以度中心度（DC）和介度中心度（BC）均大于上四分位数的靶点作为核心靶点，进一步分析。

1.6 GO 和KEGG 功能富集分析

为进一步阐述青蒿对肾阴虚型GIOP 的作用机制，将“青蒿-肾阴虚型GIOP”共同靶点基因数据导入metascape 数据库（https://metascape.org/gp/index.html）进行GO 功能富集分析和KEGG 功能富集分析，并通过微生信在线软件绘制相关柱状图和气泡图。

1.7 实验材料与仪器

青蒿购于河北安国市场，经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量副教授鉴定，密封存放于干燥阴凉处。称取青蒿粉末1g，加入60%乙醇50 ml，室温冷浸7 d，过滤得滤液，55 ℃旋蒸浓缩后，55 ℃烘干备用[12-13]。

其他试剂及生产厂家：地塞米松（大连美仑）；胎牛血清（Gibco，美国）；DMEM 培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成）；BCA 蛋白检测试剂盒、MTT（上海碧云天生物技术有限公司）；PI3K、AKT、p-AKT、GADPH抗体（CST 公司）。

1.8 原代成骨细胞的分离

以二次消化法从新生大鼠颅骨盖中分离获得原代成骨细胞[14]。

1.9 细胞培养和传代

以含10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM培养基培养成骨细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞铺满80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

1.10 成骨细胞增殖及ALP 检测

取3-8 代的成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×104个/ml 细胞悬液接种于96 孔板。24 h后分别更换为含药培养液（DEX: 10 μmol/L；AE:100、50、25 μg/ml）。给药48 h 后采用MTT 法检测成骨细胞的增殖情况。

取3-8 代的成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×104个/ml 细胞悬液接种于24 孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d 更换1 次含药培养液。第8d 裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13 800×g离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞ALP 活性。

1.11 Western blot 法检测PI3K、AKT、p-AKT 蛋白的表达

将3-8 代的成骨细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA 试剂盒进行蛋白定量。采用Westernblot 技术对PI3K、AKT 和p-AKT 水平进行检测。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 肾阴虚型GIOP 相关靶点筛选

通过Genecards 数据库共检索到GIOP 相关靶点基因1 741 个，通过OMIM 数据库共检索到GIOP 相关靶点基因311 个，通过Drugbank 数据库共检索到GIOP 相关靶点基因30 个，将3 个数据库检索结果合并后去除重复基因后，最终获得2039 个。通过Genecards 数据库检索获得阴虚靶点基因876 个，肾虚靶点基因4 603 个，交叉分析后获得肾阴虚靶点基因836 个。将肾阴虚靶点基因和GIOP 靶点基因交叉分析后获得522 个肾阴虚型GIOP 靶点基因（图1）。

图1 “青蒿-肾阴虚型GIOP”交集靶点基因

2.2 青蒿活性成分筛选

通过TCMSP 平台共检索到青蒿中OB≥30%，DL≥0.18 的活性成分22 个，见表1。

2.3 靶点预测和基因名添加

通过TCMSP 和UniProt 数据库获得214 个青蒿活性成分靶点基因。将其与肾阴虚型GIOP 疾病靶点基因交叉分析（图1），“青蒿-肾阴虚型GIOP”交集靶点基因共有98 个。

2.4 靶点基因蛋白互作（PPI）网络及拓扑分析

运用String 在线软件构建出“青蒿-肾阴虚型GIOP”共同靶点PPI 网络（图2），共有98 个节点，1935 条相互关系，见图2。利用CytoNCA 插件计算网络节点的DC，BC 上四分位数为59、101.492 48，故以DC≥59、BC≥101.492 48 为筛选条件，筛选青蒿治疗肾阴虚型GIOP 的核心靶点，共得到17 个核心靶点，如表2。

表2 “青蒿-肾阴虚型GIOP”核心靶点信息

2.5 GO 和KEGG 功能富集分析

GO 富集分析获得5 612 个细胞生物学过程，其中BP 分析获得4 649 个条目，MF 分析获得585 个条目，CC 分析获得378 个条目，根据富集的基因数进行降序排列，分别选取前10 个条目建立BP、MF、CC 三合一柱状图（图3）。生物学过程（BP）主要涉及激素应答、性腺发育、细胞死亡的正向调节等，细胞成分（CC）包括细胞外基质、转录调节复合物、膜筏等，分子功能（MF）包括信号受体调节活性、蛋白结构域特异性结合、激酶结合等。

图3 BP、MF、CC 三合一柱状图

KEGG 富集分析获得225 个信号过程，根据富集的基因数进行降序排列，选取前20 个条目建立气泡图（图4），KEGG 富集分析主要涉及的信号通路有PI3K/AKT 信号通路，IL-17 信号通路，AGE/RAGE 信号通路，MAPK 信号通路等，说明青蒿治疗肾阴虚型GIOP 可能是从多条信号通路联合发挥作用的，其中PI3K/AKT 信号通路上富集的共同靶点最多。

图4 KEGG 气泡图

2.6 细胞实验

2.6.1 青蒿显著提高DEX 损伤的成骨细胞的增殖及分化

DEX 损伤成骨细胞后，其增殖能力及ALP 活性显著降低。药物治疗后，青蒿提取物可显著促进DEX 损伤的成骨细胞的增殖，提高ALP 活性，促进DEX 损伤的成骨细胞的增殖（图5）。

图5 青蒿对DEX 损伤的成骨细胞的增殖(A)及分化(B)影响(n=6，

2.6.2 青蒿对DEX 损伤的成骨细胞PI3K/AKT 通路蛋白的影响

药物处理DEX 损伤的成骨细胞48 h 后，Western blot 结果显示，与空白组比较，模型组p-AKT/AKT 比值、PI3K 蛋白表达水平明显下降，给予青蒿提取物治疗后，p-AKT/AKT 比值、PI3K 蛋白表达水平明显提高（图6）。

图6 青蒿对DEX 损伤的成骨细胞PI3K/AKT 通路蛋白的影响(p-AKT/AKT:A-B, PI3K/GAPDH:C-D)(n=3，

3 讨论

研究发现，PI3K/AKT 通路与氧化应激有密切的联系，一方面，过量的活性氧（ROS）可抑制AKT 的磷酸化[15]，另一方面，磷酸化的AKT 也可以通过Nrf2/HO-1 通路抑制氧化应激[16]。在OP 的治疗药物探索过程中，抗氧化是一条重要的线索，如啤酒花中的黄腐酚，杜仲中的绿原酸，黄连中的小檗碱，其抗骨质疏松的机制均与抗氧化有关[17-19]，现代药理研究已经证明青蒿具有抗氧化，抗炎，调节免疫等作用[20-21]，但青蒿中化学成分众多，虽然目前多以倍半萜类成分青蒿素含量作为其质量评价标准[22]。然而，除了倍半萜类成分外，青蒿中还存在黄酮类成分、有机酸类成分等等[23]，青蒿的抗肾阴虚型GIOP 的机制可能与抗氧化有关。研究发现，倍半萜类成分、黄酮类成分、有机酸类成分均存在一定的抗氧化效果[24-27]，青蒿的抗肾阴虚型GIOP 的机制可能与抗氧化有关。因此，研究青蒿是否在抗OP 方面存在作用，青蒿中哪种单体成分在其抗OP 的过程中起主要作用值得进一步探究。

本研究以网络药理学为基础，初步筛选出了青蒿抗肾阴虚型GIOP 的98 个共同靶点，通过拓扑分析，筛选出了17 个核心靶点。GO 分析和KEGG富集分析发现这些共同靶点参与了多个生物学过程，且参与PI3K/AKT，IL-17，AGE/AGE，MAPK 等多个信号通路，其中PI3K/AKT 信号通路上富集的共同靶点最多。研究表明，PI3K/AKT 信号通路可通过影响成骨细胞的增殖和分化，抑制OP 的发生[28]。本研究体外实验亦证实青蒿可以促进DEX损伤的成骨细胞的增殖和分化，激活PI3K/AKT 信号通路，促进AKT 的磷酸化，验证了网络药理学的预测结果，为后续青蒿抗GIOP 研究提供了科学依据。