靶向HSP90抗肿瘤天然药物的研究进展

马颖超，张凌晗，冷小敏，朱秀志，谢富华

（1. 赣南医学院基础医学院；2. 赣南医学院基础医学院生物技术教研室，江西 赣州 341000）

热休克蛋白90（Heat shock protein90， HSP90）主要存在于真核和原核细胞中，是细胞内最重要、含量最丰富的分子伴侣蛋白，在维持细胞内蛋白的稳定构象与正常功能中起重要作用。天然药物通过与HSP90 的调节位点结合引起HSP90 构象改变，并诱导底物蛋白的降解，从而发挥抑制作用，抑制HSP90 下调其下游蛋白并影响肿瘤进程，使其成为肿瘤治疗的新靶点。本文对靶向HSP90 抗肿瘤天然药物的分类、作用机制及其研究进展进行综述。

1 HSP90的生物学特性

1.1 HSP 的发现与分类热休克蛋白（HSP）是生物体在受到物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而产生的一类蛋白质。HSP 蛋白是1962 年意大利科学家RITOSSA F M 发现的，他在研究果蝇唾液腺染色体时，发现当这些果蝇被无意中置于高温下，染色体中会出现特征性膨胀［1］。因此，他推断这种“膨胀”现象是由于热应激后基因激活导致特定蛋白质的表达增加。1974 年，有人从果蝇幼虫的唾液腺等部位分离到新的蛋白质，并把它命名为“热休克蛋白”［2］。根据同源程度和分子量的大小，热休克蛋白共分为5 类，分别为大分子热休克蛋白（100～110 KD）、HSP90（83～93 KD）、HSP70（66～78 KD）、HSP60（60 KD）以及小分子热休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）（15～30 KD）。其中，人类的HSP90蛋白根据其细胞定位又可分为4种亚型：存在于胞浆中的HSP90α和HSP90β、存在于内质网中的葡萄糖调节蛋白（GRP94）以及存在于线粒体基质中的HSP75/肿瘤坏死因子受体相关蛋白-1（Tumor necrosis factor receptor-associated protein1，TRAP-1）［3］。

1.2 HSP90的结构HSP90 在细胞内主要存在形式是同源二聚体，其中每个单体包括3 个高度保守的结构域：N 端结构域（N-terminal domain， NTD）、C端结构域（C-terminal domain， CTD）和中间结构域（Middle domain， MD）［4］，每个结构域执行特定的功能。NTD 与ATP 结合，也称为核苷酸结合位点。CTD 负责蛋白质的二聚化，并含有特殊的序列MEEVD 或KDEL，其取决于HSP90 的亚型及其在细胞质或雌激素受体（Estrogen receptor， ER）中的定位水平［5］。

1.3 HSP90的功能热休克反应的主要调节因子是HSP90，是细胞内最重要、含量最为丰富的分子伴侣蛋白，在维持细胞内蛋白的稳定构象与正常功能中起着重要作用［6］。其功能是将新生的多肽链折叠成活性构象，促进聚集或错误折叠的蛋白质纠正，还可通过泛素-蛋白酶体途径对蛋白质进行加工。据报道，HSP90 在肿瘤细胞中具有较高的ATP 酶活性，其对肿瘤细胞中抑制剂的结合亲和力是正常细胞的20～200 倍［7］。BIEBL M M 等［8］发现HSP90 具有稳定致癌蛋白的独特作用，可以作为癌症治疗的靶点。此外，研究结果表明，HSP90在肝癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌等肿瘤中过表达，肿瘤的恶性程度和预后程度跟HSP90 的高表达有关，抑制HSP90可以下调下游蛋白、促进肿瘤细胞凋亡和延缓肿瘤进展［9-14］。

2 靶向HSP90的天然药物及其抗肿瘤作用

由于具有多种生物活性和理想的治疗效果，天然药物已经得到了越来越多的关注，在抗肿瘤药物的研究中也占有相当大的比例。这些药物除了直接抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡，还可通过免疫调节、抑制转移等作用间接诱导肿瘤细胞死亡。比如紫杉醇是靶向HSP90 的天然药物，其通过阻滞细胞周期从而诱导细胞凋亡；表没食子儿茶素没食子酸酯可通过抑制HSP90 伴侣功能诱导肿瘤细胞凋亡；鱼藤素具有抗血管生成作用以及对细胞转化和多种癌细胞有较强的抑制作用；水飞蓟宾是HSP90-C末端抑制剂，可诱导几种HSP90 依赖性客户蛋白的降解。

2.1 靶向HSP90并促进肿瘤细胞凋亡的天然药物

2.1.1 紫杉醇紫杉醇（Taxol）是一种来源于红豆杉科植物红豆杉的根、树叶以及树皮的次生代谢物，分子式C47H51NO14。其可增加微管蛋白聚合、微管蛋白捆绑、细胞周期阻滞［15］。实验证实，紫杉醇可诱导肺癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞凋亡［16-18］。研究发现，通过亲和纯化紫杉醇可与HSP90 结合，从而产生刺激反应［19-21］。这种刺激反应不仅使恶性肿瘤对紫杉醇敏感，而且对神经保护剂的开发有指导作用。紫杉醇与HSP90 结合的位点尚未阐明，但有研究［22］表明，紫杉醇对胃癌细胞SGC-7901生长的抑制作用呈剂量和时间依赖性。紫杉醇诱导SGC-7901细胞凋亡具有典型的特征，包括染色质凝集、染色质新月体形成、细胞核碎裂和凋亡小体形成等形态学改变，其还可降低SGC-7901细胞Bcl-2表达，上调Bax表达，从而促进细胞凋亡［22］。

紫杉醇是细胞阻断剂，能够诱导多种癌细胞凋亡，它的抗癌效果与其诱导细胞凋亡的能力密切相关。紫杉醇对人绒癌细胞的主要作用靶点是微管系统。其能促进微管聚合，抑制微管降解，使细胞分裂阻滞在G2/M 期。在同一浓度的紫杉醇作用下，细胞凋亡率随着作用时间的延长而增加［16］。紫杉醇具有抑制肿瘤发展和提高生存率的作用，但因溶解度差、骨髓毒性、过敏反应和耐药性等问题制约了其临床应用，因此，紫杉醇常与其他化疗药物联合应用，以增强抗肿瘤作用，减少不良反应。比如，ROUSSEL E 等［23］将紫杉醇和冬凌草甲素衍生物Geridonin 联用，Geridonin 通过激活Caspase 级联增强紫杉醇诱导的细胞凋亡。Geridonin 和紫杉醇协调凋亡的作用是通过线粒体途径，通过上调凋亡蛋白的同时下调Bcl-2 家族的抗凋亡。其主要通过ROS 介导的PTEN/PI3K/Akt 途径协同抑制胃癌细胞增殖，ROS 的积累是紫杉醇诱导细胞凋亡的关键步骤。

2.1.2 表没食子儿茶素没食子酸酯表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG）是绿茶中的重要成分，分子式：C22H18O11。其是HSP90的一种新型抑制剂，具有抗炎作用，抑制促炎细胞因子活性。EGGC 可通过抑制HSP90 同型二聚体降低与癌症相关的HSP90 客户蛋白ErbB2、Raf-1、p-AKT、p-ERK 以及Bcl-2 等水平。其机制是通过其在HSP90的C末端ATP结合位点处或附近结合的能力，通过破坏ATP 结合，诱导不正常的构象变化，并抑制HSP90伴侣功能［24］。

EGCG 可降低线粒体膜电位，支持G0/G1 期细胞周期阻滞，从而促进肝癌细胞凋亡。此外，EGCG诱导癌细胞凋亡与Bcl-2 和NF-κB 表达显著降低有关［25］。EGCG 也可以抑制食管癌生长，诱导凋亡，降低Bcl-2 蛋白表达，增加Caspase-3 和Bax 蛋白表达。在25～400 μg·mL-1的剂量范围内，用不同浓度的EGCG 处理食管癌细胞Eca109 和Ec9706 细胞24 h和48 h 后发现，细胞存活率呈剂量和时间依赖性。用不同浓度的EGCG 处理24 h 后发现，与对照组相比，Bcl-2 蛋白表达显著下调，Bax、Caspase-3 蛋白表达显著上调［26］。

2.1.3 鱼藤素鱼藤素（Deguelin）是从非洲植物Mundulea sericea（豆科植物）和其他植物中分离出来的鱼藤类化合物［27］。其是一种HSP90 抑制剂，对细胞转化和多种癌细胞有较强的凋亡和抗血管生成作用，但对正常细胞无细胞毒性［28-29］。鱼藤素可在不同类型的肿瘤细胞中诱导凋亡，包括结肠癌、胃癌、白血病、乳腺癌和肝癌细胞［30-34］。最近研究［35］发现，鱼藤素具有抗癌活性的部分原因是它与HSP90α 的ATP 口袋结合，导致许多HSP90 客户蛋白的表达下降，包括突变的p53、细胞周期素依赖激酶4（CDK4）、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）激酶1/2（MEK1/2）、AKT 和低氧因子（HIF）-1α，以及已知的鱼藤素靶点如环氧化酶-2（COX-2）、坏死因子κB（NF-κB）和核孔蛋白98 kDa（NUP98）。鱼藤素也是PI3K 和Akt 的天然抑制剂，可通过阻断细胞周期的G2/M 期和增加癌前和恶性细胞的凋亡来抑制细胞增殖［36］。鱼藤素已被证明可通过灭活Akt磷酸化诱导肿瘤细胞凋亡［37］，在肿瘤发生、转移、凋亡和血管生成的综合过程中，因在诱导凋亡细胞和防止肿瘤恶变方面起着关键作用。XU H等［38］推测，鱼藤素可通过诱导ROS抑制下游的Akt通路，从而导致细胞死亡。鱼藤素还增加了Bax 活性，同时导致Caspase-3和Caspase-9 裂解和Bcl-2 表达下调，从而诱导肺SCC 细胞凋亡。其诱导细胞凋亡机制主要表现为Bax上调、Bcl-2下调和Caspase-3激活。

2.1.4 水飞蓟宾水飞蓟宾（Silybin）是一种来自水飞蓟的类黄酮，具有多种药理活性，包括对各种肿瘤细胞的抗增殖和凋亡活性。水飞蓟宾被鉴定为HSP90-C 末端抑制剂，能够诱导几种HSP90 依赖性客户蛋白，比如HER2、Raf-1 和Akt，以浓度依赖性方式降解，而自身水平保持恒定［39］。用不同浓度的水飞蓟宾处理HepG2 细胞，促凋亡蛋白p53、Bax、APAF-1 和Caspase-3 表达上调，同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的水平。

大量证据表明，线粒体与凋亡细胞死亡有关，线粒体去极化和Cytc释放间存在直接关系，APAF-1是一种130 kD 的蛋白质，在线粒体控制细胞凋亡中起核心作用。水飞蓟宾治疗可引起肝癌细胞中APAF-1的表达，并与释放的形成Cytc的凋亡体相互作用，从而激活Caspase-3，促进肿瘤细胞凋亡［40］。用不同浓度水飞蓟宾处理MDA-MB-231 和MCF-7细胞后发现，p-JNK 表达增加，p-ERK1/2 和p-P38表达降低。证实水飞蓟宾诱导MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞凋亡与MAPK 信号通路的调节有关。Western blot 结果表明，MDA-MB-231 和MCF-7 细胞中促凋亡蛋白Bax 表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少［41］。WANG Y X 等［42］研究发现，水飞蓟素能有效诱导胃癌MGC803 细胞凋亡，使MGC803 细胞阻滞于G2/M 期，同时在蛋白和mRNA 水平上降低p-STAT3 及其下游靶基因Mcl-1、Bcl-xl、Survivin 的蛋白表达。此外，水飞蓟宾还引起Caspase-3 和Caspase-9 蛋白及mRNA 水平的增加。水飞蓟素还可通过下调CDK1、CyclinB1、Survivin、Bcl-xl、Mcl-1和激活Caspase-3、Caspase-9，通过STAT3 途径诱导MGC803细胞凋亡并引起细胞周期阻滞。

2.2 干扰HSP90辅助伴侣的天然药物研究表明，HSP90 与其底物蛋白之间的相互作用还需要一些辅助伴侣分子（Co-chaperones）的参与，如HSP70、HOP、CDC37和P23等。这些蛋白激酶在细胞周期、信号转导和基因表达中都起着重要的作用，其中，CDC37 的作用是独一无二的，它可以特异性地介导多种蛋白激酶与HSP90的结合。

2.2.1 芹菜素芹菜素（Apigenin）是一种广泛存在于芹菜、洋葱、苹果、橘子等蔬菜水果中的黄酮类化合物，其在芹菜根中最为丰富。芹菜素具有多种生物学作用，如抗肿瘤、抗炎、镇静、降压等［43］。研究表明，芹菜素作用于原代多发性骨髓瘤细胞24 h后，能促进HSP90/CDC37 的多个底物蛋白（Raf-1/Scr 和Cdk4）发生降解，伴随HSP90 功能抑制，细胞内Caspase-8 和Caspase-3 活化，诱导细胞凋亡。Western blot 结果显示，芹菜素可降低Mcl-1、Bcl-2、Bcl-XL、XIAP 和Survivin 等多种抗凋亡蛋白的表达，PARP 前体表现出类似的减少，伴随着其裂解片段水平的增加，这些数据表明芹菜素可诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡［44］。芹菜素能够对前列腺癌细胞系、多发性骨髓瘤细胞系及原代骨髓瘤细胞产生广泛的影响，如抑制细胞增殖、阻断细胞周期、诱导细胞凋亡，但对正常的外周血单个核细胞几乎没有影响，提示芹菜素具有潜在的临床应用开发前景。

2.2.2 雷公藤红素雷公藤红素（Celastrol，CSL）又名南蛇藤素或南蛇藤醇，是从雷公藤根皮中提取出的一种三萜单体，具有抗炎、治疗神经性退化疾病等多种药理活性，分子式C29H38O4。从结构上看，其芳香酮基上的C2 和C6 有很强的亲核活性，从而具有抗肿瘤、抗微生物、抗氧化、细胞毒性和抗疟疾等作用［45］。雷公藤红素是一种新型的HSP90 抑制剂，能抑制细胞周期相关蛋白Cdk2/4/6、Cyclin D1（均为HSP90 客户蛋白），同时，雷公藤红素能抑制HSP90 的ATP 酶活性，破坏HSP90-Cdc37-Cdks 复合物，使Cdk4、Cdk6、Cdc37 从HSP90 复合体中解离［46］。

XU L N 等［47］发现，雷公藤红素可诱导卵巢癌细胞生长抑制、使细胞周期停滞在G2/M 期，增加细胞内活性氧（ROS）积聚，诱导细胞凋亡，从而抑制卵巢癌细胞的生长。LIU X H 等［48］证实了雷公藤红素对胶质瘤细胞的抗肿瘤作用，阐明了其通过调节ROS/JNK 和Akt/mTOR 信号通路诱导胶质瘤细胞在G2/M期阻滞、凋亡。细胞实验结果显示，在雷公藤红素的作用下，早期和晚期凋亡细胞均呈剂量依赖性增加；Western blot 检测与细胞凋亡相关的中枢信号蛋白的表达证明，雷公藤红素能显著提高PARP 和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 蛋白水平，且呈时间和剂量依赖性［48］。

3 结论与展望

近些年，HSP90 成为肿瘤分子靶向治疗的新靶点。通过对几种作用于HSP90 的天然药物的探讨，我们发现，其通过不同的作用机制诱导肿瘤细胞的凋亡，既可以通过抑制信号通路的方式，也可以通过与HSP90 的辅助伴侣分子结合的方式诱导细胞凋亡。天然药物既可以单独作用于癌细胞，也可以与其他化合物联用，可能会引起更好的药效。随着对HSP90 生物活性的研究，其作用机制更加明确，肯定可以发现毒性较低、对癌症患者的治疗更为有益的天然药物或化合物。