阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征大鼠实验干预模型构建方法的研究进展

余鸣涛 詹 璐

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnoea syndrome，OSAHS）指的是在睡眠中反复出现上呼吸道阻塞，从而导致氧饱和度反复下降和碎片化睡眠，其特征性的缺氧方式为慢性间歇性缺氧[1]。OSAHS 在2～8 岁儿童中的患病率约为2%，发病主要与上呼吸道阻塞和塌陷有关，导致夜间气体交换发生不同程度的改变。实验干预大鼠模型是目前OSAHS 研究领域主要采用的模型，其中主要分为经典的慢性间歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）模型和近年来进展迅速的上呼吸道阻塞模型，对于大鼠OSAHS 模型建立，特别是对于儿童OSAHS 大鼠模型建立的研究很少。本文主要总结了几种近年具有代表性的OSAHS 实验干预大鼠模型造模方法，以期为儿童OSAHS 大鼠模型的建立提供思路。

1 CIH 模型

CIH 模型指的是利用间歇性低氧来模拟阻塞性睡眠呼吸暂停中反复发生的短暂缺氧和复氧。暴露于间歇性低氧的大鼠表现出血压增高和左心室肥大，与人类OSAHS 患者中的病理相符合。CIH 大鼠模型在每次低氧事件中都会引起“憋醒”，最终破坏整体睡眠结构，抑制快眼动睡眠并诱发“困倦”，这与人类OSAHS 患者的临床表现非常相似，因此CIH 大鼠模型常用于模拟临床中的OSAHS 人类患者[2]。

1.1 低氧舱中氮氧循环的方法 将大鼠置于可调节气体浓度的低氧舱中，先在低氧舱中加氮气至氧气浓度为7%，维持缺氧1 min，加氧气至氧浓度为20%，维持复氧0.5 min。上述步骤为一循环，每个循环1.5 min，每天09∶00～17∶00 重复上述循环。整个试验持续56 d。第0、14、28、42 和56 天监测大鼠血压，以血压大于150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作为成功建立动物模型的标准[3-4]。

此种类型的模型建立较为简单，在造模试验操作中的可行性较高，符合OSAHS 患者间歇缺氧和复氧的生理特点。但本试验只是考虑了单一的间歇性缺氧的因素。研究表明，OSAHS 与中枢性睡眠呼吸暂停低通气综合征的区别在于上呼吸道阻塞的因素，但此造模方法只是通过模拟间断的低氧血症从而模拟OSAHS 的病理生理，未模拟出上呼吸道阻塞的因素。同时，虽然普遍认为OSAHS 会导致高血压，但血压升高是一个特异性低的指标，将血压升高设立为证明造模成功的标志是否准确尚无定论[2]。在临床中，患者年龄段、性别、基础身体条件的不同往往会导致OSAHS 的发生率、症状及预后有很大的区别[5]。此外，OSAHS 的一项重要特征为其发生在睡眠中的间歇性缺氧。已经有学者指出，OSAHS 的这种特殊表现方式与神经机制有关，CIH 模型虽然可以模拟睡眠紊乱，但需要进行多导睡眠监测等评估睡眠状态的方式证明[6]。

1.2 睡眠中的氮氧循环方法 将大鼠置于可调节气体浓度的低氧舱中，12 h/12 h 光暗循环。向低氧舱内通氮气，至舱内氧浓度为9%，持续1.5 min，氧浓度在之后1.5 min 内逐渐恢复到21%。上述操作为1 个循环，每次循环持续时间为3 min。在大鼠睡眠时间中不断重复上述循环，每天8 h，每周7 d，持续3 周。通过观察CIH 大鼠左心室舒张压降低和冠状动脉阻力增加，冠状动脉内皮细胞损伤和内皮依赖性血管舒张功能障碍，冠状血管中内皮缩血管肽（ET）-1 和内皮素A 受体（endothelin A receptor）的表达增加来判断大鼠实验模型建立成功[7]。

此种造模方法主要控制了“睡眠”的变量，更符合OSAHS 的病理生理特征。造模成功的判定标准更具体客观全面，与人类患者心室重构、心肌细胞损伤的临床病理及OSAHS 引发冠状动脉高压及左心室重构的表现相对应，从而判断其模型成功建立。缺陷在于大鼠睡眠状态的准确性难以保证，试验中并没有一个定量或定性的指标可以判断大鼠的睡眠状态，通过啮齿类动物的昼夜规律来进行粗略的睡眠与清醒的判定不够准确，衡量阻塞性睡眠呼吸暂停严重程度的关键指标是呼吸暂停低通气指数（AHI），当患者夜间大部分时间处于清醒状态时，AHI 会产生极大的影响，导致临床记录数据的错误而影响医生的评估，在大鼠模型中亦是如此，因此在造模中也应当将睡眠因素纳入考量范围内[8]。

1.3 智能低氧舱氮气与空气循环输入方法 将大鼠置于有智能集成系统控制的低氧舱中（同时装有气体传感器、氧气检测仪），设定空气和氮气的通气压力0.2 MPa，空气流量300 L/h，氮气流量500 L/h。先通入空气至舱内氧浓度为21%，维持40 s，再通入氮气，使舱内氧浓度为5%，维持40 s，缓冲时间各5 s。上述步骤为一循环，每次循环时间为80 s，相当于每小时36 个循环，从而模拟每小时36 次的低氧事件，与临床中的重度OSAHS 程度相对应。上述循环每天持续8 h，时间为9∶00～17∶00，连续饲养9 周。每日实验开始前都进行低氧浓度测定以减少实验误差。当大鼠肝脏组织病理切片观察到中央静脉区、肝血窦及肝细胞索区大量脂质积聚、白色的脂肪空泡形成大小不一；肝小叶和门管区均肝细胞脂质染红显著来确认OSAHS 大鼠模型造模成功[9]。

本造模方法的创新点是其通过改变低氧事件的发生频率从而实现了OSAHS 大鼠模型的可分度，OSAHS 诊断标准中的一条是AHI≥5，AHI 5～15 为轻度，16～30 为中度，＞30 为重度。此外，其采用了智能集成系统的低氧舱，并设定了与通气对应的舱内氧气浓度，大大降低了人工成本。低氧舱内气体改变的缓冲时间控制在5 s 以内，确保了试验的精确性。在低氧舱中通入的气体为空气及氮气混合输入，总实验事件达9 周，更符合大多数OSAHS 患者的自然生态和生理特性。这些操作可能使造模试验的环境与临床中人体的环境条件更为相似。但试验对于设备的要求较苛刻，需要可编程逻辑控制器、电脑自动控制和自动数据采集装置，主机与低氧舱和气路控制系统之间需要统一协调工作。而且本试验忽略了睡眠与上呼吸道坍塌这两种重要的神经和解剖因素。本质上，该试验仍是以缺氧为核心，包括后期评估造模成功也是利用缺氧对肝脏损伤的机制判断。但OSAHS 作为一种累及多系统和器官的综合征性疾病，将致病因素局限于缺氧，忽略诸如肥胖、上气道阻塞、睡眠等因素，不够严谨。另外，本试验仅对低氧舱环境进行氧浓度检测，缺乏对大鼠的血氧饱和度定期检测，因此无法准确判断大鼠的血氧饱和度降低到了90%以下[5]。

总的来说，CIH 被认为是OSASH 毒性较大的刺激之一，CIH 模型是目前应用最广泛的OSAHS 模型。CIH 模型可调节间歇性低氧的浓度、频率和复氧时间，从而诱发不同程度的OSAHS[10]。此模型最早由Fletcher 等人在1992 年的一项研究中率先建立，发现在人类OSAHS 和大鼠CIH 中都存在全面性高血压的共同表型，从而为大鼠模型作为研究OSAHS 病理后遗症的提供了早期证据[11]。但CIH 模型无法准确控制大鼠的上气道压力，无法模拟气道阻塞或塌陷的情况，以及无法模拟高碳酸血症。OSAHS 是发生于睡眠中的间歇性低氧，而CIH 模型不能精确地在大鼠睡眠中给予CIH 刺激，制造睡眠呼吸紊乱模型。不同CIH 造模试验对于复氧气体选择不同，有研究称用空气进行复氧更符合OSAHS 患者的日常生理情况，但目前尚无证据表明用空气或氧气复氧会对实验结果产生影响[12]。

2 上呼吸道阻塞模型

上呼吸道阻塞模型指的是围绕阻塞性睡眠呼吸暂停所伴随的上呼吸道塌陷和胸腔负压来建立大鼠模型，这是CIH 模型无法模拟的。

2.1 透明质酸注射方法 大鼠软硬腭交界处是产生OSAHS 的最佳注射部位，不会完全堵塞呼吸道，导致呼吸暂停、间歇性缺氧和睡眠中觉醒，并诱发与人类OSAHS 相同的胸内负压变化。试验开始时，大鼠腹腔注射麻醉，在模型组大鼠软硬腭交界处注射0.1 mL透明质酸钠凝胶（15 mg/mL）1 次，建立人为上呼吸道阻塞，饲养3 个月。模型大鼠在睡眠期间出现嗜睡、疲劳、打鼾的表现，负压持续时间高于正常时间，发生4～10 次/h 的呼吸暂停事件；模型组的血氧分压、血氧含量和血氧饱和度显著低于对照组；通过光镜和电镜观察到模型组大鼠气管表面覆盖复杂的柱状纤毛上皮细胞，皮下黏膜轻度水肿，并且周围的气管腺（浆液腺）增多，分泌物滞留，心肌细胞排列紊乱，出现空泡变性，部分心肌细胞出现浓缩和凝固性坏死，伴有弥漫性肿胀、肌浆溶解、横纹不清、间质血管充血，表明心肌肌原纤维受损，证明造模成功[13]。

此试验大鼠均造模成功，无感染、无结节形成或发生其他并发症，安全性佳。通过在麻醉大鼠咽部注射透明质酸钠以模拟OSAHS 患者睡眠时上气道阻塞的病理生理模型，建立的模型特征与临床相符：OSAHS 患者通常具有上呼吸道狭窄的体征（颈围增大、巨舌症、扁桃体肥大等），特别是在儿童中，通常存在气道部分阻塞。

OSAHS 中患者一般表现为总体持续，局部间断的上呼吸道反复塌陷，模拟反复的阻塞过程可能是此试验改良的一个方向。此外，它忽略了不同个体间的上呼吸道张力的差异，造模大鼠会出现4～10 次/h的呼吸暂停，但无法定量控制其变量而模拟不同的分度。在临床中，常常根据鼻咽侧位片将腺样体肥大进行分度，也许可以对大鼠进行同样的X 线评估而对呼吸道阻塞程度进行分级而研究腺样体肥大，扁桃体肥大对OSAHS 的分级是未来研究的方向[14]。

2.2 气管切开术方法 大鼠肌注麻醉，在垂直平面上切开1.5 cm 的切口后，解剖颈部中线的组织到达气管，切开气管，至少10 s 后放置气管插管（模拟呼吸暂停发作）。在此过程中，监测大鼠氧饱和度。当饱和度降低到85%以下（缺氧期）时，测量听力指标，同时保证在实验过程中至少有1 次呼吸暂停使大鼠氧饱和度降低到85%以下，产生呼吸暂停，并立即进行重新测量氧饱和度及听力水平。通过实验过程中确保大鼠氧饱和度降低到85%以下，并观察到至少1次的呼吸暂停，以及发现模型组大鼠前后听力水平不一致来验证模型的成功建立[15]。

氧饱和度在OSAHS 中是一项重要评价指标，把氧饱和度探头直接伸入气管内以确定在大鼠体内有缺氧事件的发生，符合目前对于OSAHS 的诊断标准，是最为精确评价方式[16]。本试验1 次或多次的精准氧饱和度下降可能更能模拟轻度窒息患者或重度OSAHS 患者的生理状态，然而大多数的OSAHS 都表现为轻中度。此外，验证造模成功的方法仅是通过前后气管中氧饱和度水平和听力水平判断，未体现出OSAHS 所致的全身性损害，较局限。OSAHS 是一种慢性疾病，造成的多系统损害需要长期累积[17]。从实验角度上，本方法对大鼠的创伤性较大，会造成实验动物的死亡，无法与药物治疗结合，无法建立可长期观察的大鼠模型。

2.3 鼻阻塞方法 将大鼠分为对照组、单侧鼻阻塞组和双侧鼻阻塞组，麻醉后，使用高频电刀电灼阻塞模型组和单侧鼻阻塞组的左鼻孔，1 周后同样方法阻塞模型组的右侧鼻孔。对照组大鼠不进行处理。4 周后，大鼠麻醉处死，收集下颌骨，切片行苏木精-伊红及免疫组化染色和蛋白质印迹法分析。通过观察到两组鼻阻塞组大鼠的牙周膜厚度变窄，不连续，骨小梁紊乱，骨髓腔较大，骨吸收陷窝较单侧组进一步增多，骨吸收陷窝内含有破骨细胞；LC3 阳性面积率显著增大；细胞自噬标记物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增大，sequestosome 1/p62 蛋白水平显著降低；缺氧诱导因子-1α 蛋白的相对表达量显著升高来评判造模成功[18]。

此试验研究的阻塞部位是鼻部气道，并且分为单侧阻塞组和双侧阻塞组，在一定程度上实现了病情的分度。试验造模方式简洁明确，可操作性强，对探究颌面部与OSAHS 的关系有意义。在验证造模成功时采用的是通过采取下颌骨的标本进行细胞学和组织学上的测定来论证造模成功，缺少证明大鼠有血氧饱和度下降和缺氧时事件发生的指标。

总的来说，上呼吸道阻塞模型主要参照OSAHS的病理生理建立。OSAHS 通常有气道解剖变窄、气道组织塌陷，从而影响上气道口径和导致咽吸气肌功能反射障碍。肥胖、颌面部或咽部软组织异常所导致的上气道解剖口径缩小，可造成短暂性呼吸暂停或通气量减少；睡眠开始时气道肌肉或咽部肌肉活性的降低也会引起短暂性呼吸暂停，这些因素会造成暂时性的缺氧，之后肌肉活性恢复，上气道重新开放，缺氧随之解除[19]。上呼吸阻塞模型更贴近儿童OSAHS 状态。儿童OSAHS 最常见的因素是腺样体和扁桃体肥大所致咽部结构异常，从而发生睡眠期间上气道阻塞和塌陷[4，17]。但此类模型无法精准控制气道阻塞的程度，无法对模型进行OSAHS 严重程度分度，方法数据量化困难，需要手术，操作复杂，实验操作所造成的并发症较多，如窒息、伤口感染等。

3 小结与展望

实验干预大鼠模型是研究OSAHS 发病机制、危险因素、病程进展、预防和治疗中必不可缺少的，模型的建立至今尚无准确和统一的标准。CIH 模型与上呼吸道阻塞模型各有其独特的优缺点。CIH 模型建立简便，可行性高，适合长期、慢性研究，上呼吸道阻塞模型更符合儿童OSAHS 的发病机制，但建立较困难。检验造模成功可取心、肝、肺或气道组织进行前后病理学对照，对比特定蛋白或生物标志物水平，如ET-1、ET 受体、p62 蛋白、HIF-1 因子、载脂蛋白A4 或α-1A 微管蛋白[20]。

欧洲呼吸学会儿童呼吸性睡眠障碍诊疗工作组将OSAHS 定义为“一种睡眠期间上呼吸道功能障碍的综合征，特征是打鼾和/或伴有上呼吸道阻力增加或塌陷”[21]。儿童OSAHS 的病因更多会从上呼吸道功能阻塞的方向进行考虑，睡眠因素在其中尤为关键。现对未来儿童OSAHS 模型的建立提出可能的研究方向：通过在大鼠上连接脑电图和多导睡眠检测仪，实时检测其睡眠状态及呼吸状态，用手术方法在咽部、上气道建立可调节的梗阻状态，通过影像学确定其上呼吸道阻塞分级，定期测定其血氧饱和度，在睡眠时行睡眠监测和脑电图监测，记录AHI 和最低氧饱和度；一定时间后通过测定其生物蛋白，心、肝、气道部位组织病理切片，四肢血压，心功能以及肺功能，颌面部结构改变，特别是评价睡眠紊乱状态的形成，以多角度确定造模试验的成功性。相信随着研究的深入和科技的进步，一定会有创新性的模型出现。