晚期非小细胞肺癌患者外周血CD8+T 细胞表面NK 相关受体表达及与预后的相关性分析

黄郑铭 朱 丹 陈 慧

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见类型之一，预后较差，5 年生存率不足20%，尤其是晚期患者5 年生存率仅2%左右[1-2]。寻找精准可靠、能够实时预测预后的指标成为临床亟待解决的问题。肿瘤免疫逃逸是肿瘤恶性进展的重要过程，其机制十分复杂，机体在清除肿瘤细胞时，也会对肿瘤细胞抗原性进行重塑，从而改变免疫效应细胞的监视作用[3]。CD8+T 细胞是机体关键的肿瘤细胞毒T 细胞，其细胞表面能够表达NK 相关受体，包括NK 活化性受体（NK activating receptor，NKG2D）及抑制性受体（NK inhibitory receptor，NKG2A），通过与相应配体结合发挥作用[4]。癌细胞表面表达NKG2D 配体（NKG2D ligand，NKG2DL）能够与T 细胞相应受体结合从而被清除，或表达NKG2AL 而发生免疫逃逸[5]。研究发现，中药辅助治疗晚期NSCLC 能够促进CD8+T 细胞表面NKG2D 表达，且与CD8+T 细胞毒性正相关[6]。Borst 等[7]指出，CD8+T 细胞表面NKG2A 是一种晚期免疫检查点，标志着癌细胞活跃分裂的特异性。因此，推测CD8+T 细胞表面NKG2D 与NKG2A 表达在晚期NSCLC 细胞免疫逃逸效应中发挥重要作用。本研究旨在探讨CD8+T 细胞表面NKG2D 与NKG2A表达与晚期NSCLC 患者临床预后的关系，以期为晚期患者的治疗提供指导。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2017 年10 月至2019 年9 月浙江省金华市中心医院呼吸与危重症学科收治的94例晚期NSCLC 患者，设为病例组，另按照2∶1 的比例选择与病例组性别、年龄信息匹配的47 名健康体检者为对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过（审批号：2022820101）。

1.2 纳入标准 （1）符合美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）制定的NSCLC 临床诊治指南中的诊断标准[8]，且临床分期TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期；（2）首诊患者，且经活检证实为晚期NSCLC；（3）年龄18～80 岁；（4）东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分0～3 分；（5）预计生存期3 个月以上；（6）至少有1 个可测量或可评估病灶；（7）接受外周血CD8+T 细胞表面NK 相关受体检测；（8）签署知情同意书。

1.3 排除标准 （1）既往接受放化疗、靶向治疗者；（2）伴其他部位原发性肿瘤；（3）无法明确病理类型者；（4）合并HIV、肝炎病毒感染且处于活动期者；（5）合并严重内科疾病者；（6）近3 个月服用免疫抑制剂或激素类药物者；（7）合并自身免疫性疾病者；（8）处于妊娠期或哺乳期；（9）有精神病史、器官移植病史者。

2 方 法

2.1 外周血中CD8+T 细胞表面NK 相关受体检测病例组患者确诊后治疗前，对照组在体检时，用含EDTA 抗凝剂的真空管采集空腹静脉血4 mL，摇匀备用。将20 μL 荧光标记单克隆抗体（CD3-PE-Cy7/CD8-Percp/NKG2D-APC、CD3-PE-Cy7/CD8-Percp/NKG2A-PE，抗体均购自美国BD 公司，CD3-PE-Cy7批号3410991；CD8-Percp 批号347314；NKG2DAPC 批号562064；NKG2A-PE 批号568953）加入EP管中，另设同型对照；各EP 管加入待测抗凝全血100 μL 混匀，避光孵育20 min，加入1000 μL 红细胞裂解液继续孵育10 min，离心取沉淀，PBS 重悬2次，最终用1%多聚甲醛重悬为200 μL，于BD FACSAria Ⅲ型流式细胞仪器上检测，用FlowJo7.6软件分析，以CD3 设门分选CD8+T 细胞亚群，最终分析CD3+CD8+T 细胞表面NKG2D+CD8+及NKG2A+CD8+细胞比率。

2.2 病历资料收集 调取病例组患者入院后病历资料，包括性别、年龄、有无吸烟史，病理类型、组织学分级、ECOG 评分[9]、TNM 分期及T 分期、N 分期、治疗方案（一线化疗或靶向治疗）。

2.3 随 访 采用电话或调取门诊病历的方法进行为期3 年的随访，确诊第1 年随访频率3 个月1 次，之后半年随访1 次，以患者死亡或随访时间（3 年）截止为终点事件。

2.4 统计学方法 应用SPSS 26.0 处理数据，正态分布的计量资料用均数±标准差（±s） 表示，多样本比较采用单因素方差分析，两样本比较行LSD-t 检验；计数资料用例数表示并行χ2检验；采用Kaplan-Meier 法分析NKG2D、NKG2A 表达与总生存期的关系，以COX 风险比例模型进行预后生存单因素和多因素分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 对照组与病例组一般资料比较 病例组与对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 对照组与病例组一般资料比较

3.2 对照组与病例组外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达比较 病例组外周血NKG2D+CD8+比率低于对照组，NKG2A+CD8+比率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 对照组与病例组外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达比较（%，±s）

表2 对照组与病例组外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达比较（%，±s）

注：对照组为健康体检者；病例组为晚期非小细胞肺癌患者；NKG2D+CD8+ 为CD8+T 细胞表面NK 活化性受体；NKG2A+CD8+ 为CD8+细胞表面抑制性受体

组别对照组病例组t 值P 值例数47 94 NKG2D+CD8+95.30±2.02 83.19±3.15 21.813＜0.001 NKG2A+CD8+2.86±0.35 6.42±1.17 20.376＜0.001

3.3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达与临床病理特征的关系分析 与ECOG 0 ～1 分、TNM Ⅲ期者比较，晚期NSCLC ECOG 2～3 分、TNM Ⅳ期患者NKG2D+CD8+比率较低，NKG2A+CD8+比率较高（P＜0.05）。见表3。

表3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达与临床病理特征的关系（%，±s）

表3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达与临床病理特征的关系（%，±s）

注：NSCLC 为非小细胞肺癌；NKG2D+CD8+为CD8+T 细胞表面NK 活化性受体；NKG2A+CD8+为CD8+T 细胞表面抑制性受体；ECOG 为东部肿瘤协作组

项目性别例数NKG2D+CD8+t（F）/P 值0.665/0.508 NKG2A+CD8+t（F）/P 值1.489/0.140男女56 38 84.20±3.29 84.65±3.11 6.56±1.18 6.21±1.02年龄（岁）＜60≥60吸烟史41 53 83.77±3.22 82.74±2.98 1.604/0.112 1.943/0.055 6.25±1.12 6.55±1.04 1.341/0.183 1.736/0.086无有58 36 83.68±3.24 82.40±3.11 6.27±0.97 6.66±1.19病理类型腺癌鳞癌其他组织学分级高分化中分化低分化ECOG 评分（分）0～1 2～3 T 分期T1～T3 T4 N 分期N0 N1～N3 TNM 分期73 15 6 13 44 37 90 4 59 35 15 79 83.31±3.24 83.20±3.15 81.72±3.11 84.10±3.15 83.29±3.10 82.75±3.02 83.36±3.20 79.27±3.06 83.66±3.24 82.40±3.07 84.14±3.19 83.01±3.02 0.676/0.511 0.976/0.381 2.505/0.014 1.858/0.066 1.317/0.191 5.529/＜0.001 6.37±0.95 6.57±1.10 6.60±1.18 6.39±0.95 6.43±1.12 6.77±1.21 6.38±0.85 7.29±1.38 6.28±1.04 6.65±1.18 6.10±1.07 6.28±1.13 0.365/0.695 0.406/0.667 2.041/0.044 1.585/0.116 1.203/0.232 2.594/0.011ⅢⅣ29 65 85.77±3.26 82.04±2.91 5.99±0.89 6.61±1.14治疗方案化疗靶向治疗1.885/0.063 1.094/0.277 61 33 82.72±2.97 84.05±3.24 6.51±1.12 6.25±1.06

3.4 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表达与预后的关系 截止随访结束，共有4 例失访，41 例死亡，49 例存活，死亡率为43.62%（41/94）。以平均值83.19%作为界值分为NKG2D 高表达组（46 例）和NKG2D 低表达组（48例），平均值6.42%作为界值分为NKG2A 高表达组（49 例）和NKG2A 低表达组（45 例）。Kaplan-Meier生存分析显示，NKG2D 高表达与低表达患者累积生存率分别为71.0%、40.4%，平均生存时间分别为（23.97±1.65）、（31.17±1.31）个月，且NKG2D 高表达患者总生存时间较低表达患者延长（Logrank χ2=9.763，P=0.002）；NKG2A 低表达与高表达患者累积生存率分别为66.2%、45.1%，平均生存时间分别为（30.41±1.25）、（24.80±1.73）个月，且NKG2A 低表达患者总生存时间较高表达患者延长（Logrank χ2=5.353，P=0.021），见图1。

图1 NKG2D、NKG2A 不同表达水平患者两组间累积生存率的Kaplan-Meier 曲线分析

3.5 晚期NSCLC 患者预后COX 回归分析 COX多因素分析显示，N1～N3 分期、TNM Ⅳ期、NKG2D低表达、NKG2A 高表达均为影响晚期NSCLC 患者总生存期的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 单因素与多因素COX 分析总生存期的影响因素

4 讨 论

肺癌早期缺乏特异性症状，使其确诊时多数已至晚期，寻找可靠生物标志物评估患者病情及预后有重要临床意义。T 细胞在抗肿瘤免疫中扮演重要角色。CD3+反映总体T 细胞亚群免疫状态，CD3+CD4+T细胞是辅助其他免疫细胞发挥免疫效应的亚群，其表达水平降低提示机体免疫功能下降[10]。CD8+T 细胞通过直接或间接调节抑制因子发挥与CD4+T 细胞相反的免疫学效应[11]。近年来研究发现，肿瘤浸润性CD8+T 细胞表面常表达一类独特的免疫效应子群体NKG2D、NKG2A，同时NKG2A 也表达于所有NK 细胞[12]。van Montfoort 等[13]在小鼠肿瘤模型中证实，接种抗肿瘤疫苗后NKG2A 的阻断效应是通过CD8+T细胞进行，而非NK 细胞。Mojic 等[14]在肿瘤免疫治疗中发现，NKG2D 能够延迟肿瘤生长，并增加浸润性CD8+T 细胞浸润。由此可知，CD8+T 细胞表面NK 相关受体在抗肿瘤免疫效应中发挥重要作用。

本研究显示，病例组外周血NKG2D+CD8+比率低于对照组，NKG2A+CD8+比率高于对照组，说明晚期NSCLC 患者外周血中CD8+T 细胞表面NKG2D 低表达、NKG2A 高表达。NKG2D、NKG2A 及其配体均属于先天性免疫系统的主要成员，能够触发NK、γδ 和CD8+T 细胞介导的免疫反应[15]。NKG2DL 及NKG2AL在健康细胞表面少有表达，但在病毒感染及肿瘤细胞表面表达显著增加，其与免疫细胞表面的相应受体结合后启动免疫杀伤或抑制效应[16]。Osaki 等[17]发现，胃癌细胞患者外周血CD8+NKG2D+表达降低，与本研究结果一致，说明NKG2D 低表达参与肿瘤细胞免疫逃逸。Ducoin 等[18]研究发现，NKG2A 在人结直肠癌患者中富集，且能够通过阻断NKG2A 克服抗肿瘤免疫反应，与本研究结果相符，说明CD8+NKG2A+高表达参与癌细胞免疫逃逸。

本研究发现，晚期NSCLC 患者ECOG 2～3 分、TNM Ⅳ期者NKG2D+CD8+比率较低，NKG2A+CD8+比率较高，提示NKG2D、NKG2A 表达与患者身体机能及临床分期有关。ECOG 反映患者身体抗肿瘤治疗的承受能力，在一定程度上也反映了机体的免疫功能[19]。随着病情的进展，肿瘤细胞免疫逃逸增强，Ⅳ期NSCLC 患者CD8+T 细胞表面NKG2D 表达抑制及NKG2A 表达激活更为明显，病情更为恶化[20]。本研究经Kaplan-Meier 生存分析，NKG2D 高表达患者总生存时间较低表达患者延长，NKG2A 低表达患者较高表达患者延长，进一步COX 分析证实，NKG2D 低表达、NKG2A 高表达均是晚期NSCLC 患者总生存期的独立危险因素。NKG2D+CD8+低表达时其与癌细胞表面配体结合产生的活化信号减弱，对NK 细胞毒活性的激活能力不足，而NKG2A+CD8+高表达进一步抑制了NK 细胞毒活性，二者共同促进了癌细胞逃避免疫监视，不利于免疫系统识别并清除癌细胞，预后生存期相应缩短[21-22]。

综上所述，晚期NSCLC 患者外周血中CD8+T 细胞表面NKG2D 低表达、NKG2A 高表达，二者表达情况与患者身体机能、临床分期及预后有关，可作为评估晚期NSCLC 患者预后的可靠参考指标。但CD8+T细胞表面NKG2D 免疫激活与NKG2A 免疫抑制功能在NSCLC 患者中具体如何发挥作用，仍需要进一步深入探讨。