毛发分析前沿——头发微样技术研究进展

沈 敏，严 慧，徐多麒，纪佼佼

（司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台司法部司法鉴定重点实验室，上海200063）

探寻具有科学属性、丰富信息和高证据价值的生物基质是法医毒物学领域的重要研究方向之一。毒（药）物在毛干中的保留属性赋予毛发基质具有目标物稳定、检出时限长、可反映长程摄毒（药）史的特征，奠定了毛发分析在法医毒物学以及临床毒物学、兴奋剂检测等领域的重要证据地位和应用价值[1-3]。 2016 年，ARMITAGE 等[4]在《科学》（Science）期刊上充分肯定了头发的证据价值和研究价值，认为“尽管头发的应用曾经存在争议，但现代精细分析技术将赋予头发在法医学领域的新作用，通过头发可以推断犯罪嫌疑人或受害者的个体特征甚至行为信息”。 同期，基于单根头发微样技术的研究逐渐呈现[5-10]，其对于精准表征毒（药）物在毛干中的空间分布特征，精准定位毛干中毒（药）物的浓度高峰位置，提升头发分析对于摄毒时间和摄毒模式判断的准确性，具有重要的理论意义和应用价值。

1 头发微样技术及其证据意义

1.1 头发分析及其影响因素

头发分析的应用领域及证据价值随着学界研究的深入而不断得到拓展和提升。 在司法实践中，头发分析除主要应用于摄毒鉴定、摄毒（药）史判断等案（事）件的处置外，也为药物辅助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）如性侵犯、麻醉抢劫和诈骗等案件的侦破提供案发时段是否摄毒（药）的证据。 显然，上述头发分析证据对于摄毒模式（长期摄毒、单次摄毒）的判断基于时间要素，即是否在某特定时段摄入过毒（药）物，或是否在某一时间周期内多次滥用毒品？ 然而，目前传统的头发束发分段分析对于摄毒时间和摄毒模式的估计仍处于较大的误差水平[7-9]。 如公安部制定的《涉毒人员毛发样本检验规范》（公禁毒〔2018〕938 号，以下简称《规范》）所述，“发根端3 厘米以内的头发样本检测结果为阳性的，表明被检测人员在头发样本提取之日前6 个月以内摄入过毒品”。 可见，《规范》为确保现行头发分析结果证据的可应用性且不至于形成误判，将近3 个月生长的头发（头发生长速度理论值约为1cm/月）所提供的时间信息扩展了近1 倍，或者说摄毒时间的分辨率达数月的误差水平。 显而易见，头发束发分析对于摄毒模式和摄毒时间的估计尚存在精细度不够、准确性不足的缺陷，其应用范围和证明能力因而受到制约。

毒（药）物在毛干中的保留位置是其摄入时间推断的基础。通常认为毒（药）物经血液循环主动或被动地扩散至毛乳头细胞，在形成毛髓质、毛皮质的过程中与其结合并保留于毛干中，随着头发的生长由发根向发梢有规律的位移。纵观头发束发分析的原理和实践，可以认为导致时间分辨误差问题的关键是：头发束发分析方法的原理、技术以及所提供的结果信息均是相对间接、综合和粗略的。 即对由多根头发组成的束发片段进行分析，根据毒物在一束毛干上的叠加浓度高峰位置来提供时间信息的方法，不能准确、精细和真实地显示毒物在单根毛干上的分布情况。

头发束发分段分析会受到以下因素的影响（图1）：（1）生长周期。 头发的生长呈现出周期性，分为生长期、退行期和休止期。 通常头部毛发大约有80%处于生长期，20%处于退行期或休止期。 由于所采的束发中头发处于不同的生长周期，处于生长期的头发中毒（药）物随毛干生长由发根向发梢位移，而处于休止期的头发中毒（药）物仍停留于毛干的原位或滞后位移， 故束发的片段分析所提供的是非一致的叠加信息。 （2）结合机制。 理论上认为毒（药）物进入毛干存在多种渠道，既有通过血液循环进入毛乳头细胞，在毛干形成过程中与其结合的主渠道，也存在从汗液、皮脂腺等分泌进入毛干或外部污染附着于毛干的次渠道。 而束发所导致的非一致叠加同样不能有效识别、排除次渠道的干扰信息。（3）采样误差。头部表面有一定的弧度，贴头皮剪取一束头发的采样方式可能存在所采发束中各毛干根部与头皮间距离不一致的误差。 （4）分段长度。 以厘米为单位的毛发片段分析不能有效捕捉和分辨毛干中毒（药）物的浓度高峰位置。 上述因素均可能导致头发中毒（药）物浓度高峰分布存在一定的扩散，由此与摄毒时间的对应上存在较大偏差或较为模糊。 由此可见，现行头发束发分段分析仅能提供药物的暴露信息，而在摄毒模式以及摄毒时间的评估方面证明能力有限。

图1 头发束发分段分析干扰因素示意图

1.2 头发微样技术及其信息特点

基于司法鉴定实践中的科学证据需求以及传统头发束发分析中存在的缺陷，早在2011年学者们[5，11-12]就开始探索使用基质辅助激光解吸电离质谱（matrixassisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS）研究单根头发中甲基苯丙胺、可卡因、氯胺酮等在头发中的分布情况。 然而由于该技术平台的灵敏度、分辨率尚不能完全满足单根头发中痕量外源性物质的检测要求，故突破性进展缓慢。2016 年，KUWAYAMA 等[6]提出采用单根头发的微样技术，即建立以0.4 mm（约等于头发日生长长度）为单位的单根头发微分段分析技术，从相对微观角度精准考察单根毛干中外源性毒（药）物的浓度高峰位置，以期获得更高的时间分辨率。 此后，以单根头发毫米或亚毫米分段（头发段重量为微克级）的微样技术又被称为头发微分段分析（micro-segmantal analysis，MSA），其研究团队和研究报道也逐渐增多[13-21]。头发微分段分析可以较为精准地反映单根头发中外源性物质的分布情况，并为研究毒（药）物进入头发的机制提供特有的信息。但由于所采集的研究对象（单根头发）可能涉及某些不确定因素的影响（如头发处于非正常生长期等），故大部分学者认为，MSA 分析至少应同步采集、分析5~10 根头发。

MSA 通常采用头发全发（带毛囊）样品。单根头发以毫米或亚毫米的间隔分段，然后对每段头发微样分别进行处理、分析，以此获得毒（药）物在单根头发中的浓度分布信息。 其中，对单根头发进行精准微分段是实现对亚毫米长度头发中痕量毒（药）物定量分析的前提。 头发微分段过程包括头发样本固定、长度测定、头发切割等环节，主要有手动切割法[18-19]以及改良的组织切片机切割法[5，6，13]。 手动切割法通常采用精度为0.4 mm 的定制胶带对单根头发进行测量与固定，并在台式放大镜下用手术刀片完成对单根头发的切割（图2）。 用精度为0.01 mm 的电子微分尺对所切割头发段进行测量验证，结果表明，头发段长度为（0.4±0.02）mm（n=50）时，误差在可接受的范围内[18]。 设备切割法则多采用经改良的组织切片机以0.4mm 间隔切割头发，其长度为（0.403±0.00419）mm（平均值±标准偏差，n=15）[9]。 尽管两者的操作方法不同，但均取得了较为理想的精度。

图2 单根头发0.4 mm 分段切割法

2 头发微样技术的应用研究

用涉及法医毒物学的多个数据库进行“microsegmantal analysisi，MSA”相关研究的搜索，目前研究报道主要集中于日本警察科学研究所团队、中国司法鉴定科学研究院团队、日本大阪市警察总部法科学实验室团队，以及德国慕尼黑法医毒理学中心团队。 研究内容涉及头发MSA 方法学研究、 摄毒摄药时间评估研究、毒（药）物在单根头发中的分布研究、毒（药）物进入头发机制研究、毛根中毒（药）物动力学研究等。

2.1 头发MSA 方法学研究

检测方法的高灵敏度是实现毛发微样技术研究的必要条件。 随着液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术的发展，为基于头发MSA 的应用研究提供了可能。 目前，文献报道的头发MSA 方法包括建立基于LC-MS/MS 技术平台单一或多种目标物的分析方法，涉及的目标物有苯海拉明、氯苯那敏、去甲基氯苯那敏、非索非那定、双氢可待因、麻黄碱、甲基麻黄碱、依匹斯汀、利多卡因、唑吡坦、甲氧基苯胺、艾司唑仑、西替利嗪、氯雷他定、咪达唑仑等[6-7，9，13，18，20-21]，所建方法主要用于所涉目标物的摄毒时间、毛发结合机制等应用研究，故通常以灵敏度为优先考虑因素，检出限为pg/mg 或fg/mm 水平。 由于MSA 方法中单根头发片段质量较小，因此研究者大多选择以“浓度/长度”或“浓度/段”作为量值单位。

头发MSA 方法学研究还涉及一定目标物范围的筛选分析。 德国WIEDFELD 团队[19]建立了基于LC-MS/MS 技术分析单根头发2 mm 片段中156 种毒（药）物的方法，该方法检测的156 种目标物中，有140 种（约90%）目标物的定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）≤1.25 pg/段，40 种（约26%）目标物的LLOQ≤0.125 pg/段。 并且，除氯甲噻唑在低质量控制水平下精密度较差（24.7%）外，其他所有目标物测定的精密度均满足要求。 将该方法应用于15 例单次给药案例，对药后1 个月至2 个月采集的毛发（每例采集10 根头发）进行分析，结果表明，90%的目标物的LLOQ≤1.25 pg/段，准确度较好。 在上述案例中可以检测到多种物质，然而苯二氮类药物的检测仍然具有挑战性。 笔者所在研究团队[22]建立了基于单根头发0.4 mm 片段中42 种精神活性物质的LC-MS/MS 分析方法。 单根头发微分段中42 种精神活性物质在各自线性范围内线性关系良好（相关系数r>0.99），检出限为0.2~10 pg/mg，定量限为0.5~20 pg/mg，日内、日间精密度为1.5%~12.7%，日内、日间准确度为86.5%~109.2%，提取回收率为68.1%~98.2%，基质效应为71.3%~111.7%。将该方法应用于志愿者单次服用唑吡坦28 d 后采集的头发样本的0.4 mm 分段分析，5 根头发中唑吡坦的阳性区域位于S28~S40（近根端1.08~1.60 cm），浓度范围为0.62~20.5 pg/mm，结果显示，头发MSA技术可应用于药物辅助犯罪案件的调查。

对于头发MSA 技术，人们关注的焦点是方法的灵敏度和检出能力。 笔者认为，基于MSA 技术的单一或多目标物的头发分析在检出能力方面具有双重性，一方面由于头发样品的微量导致检出限值升高，检出能力下降；另一方面由于更为精细的微分段可以减少阳性头发片段中空白头发基质对目标物的稀释作用，并降低头发引起的基质效应，从而提高检出能力。 随着色谱-质谱分析技术的发展，头发MSA 的优势将更为突显。 对于头发MSA 的筛选分析，方法优化总是基于分析灵敏度、目标物数量、时间分辨率（片段长度）三个因素间的平衡，而方法应用则要关注检出限值较高、头发中含量较低的目标物的可检出性。

2.2 摄毒摄药时间评估研究

头发MSA 的最大优势特点是通过精细的微分段精准识别外源性物质在单根毛干中的峰值位置，从而有可能在日水平上评估摄毒摄药时间及模式，为各类案（事）件的侦破、处置提供重要线索和依据。 如涉药相关的非正常死亡案件中估计死者的死亡时间，药物滥用相关案件中明确滥用者的滥用方式，药物辅助犯罪案件中提供受害人的摄药时间信息，以及通过毛干中毒（药）物的分布特征区分单次摄药的受害者和多次反复摄毒的滥用者等，进而为案件提供支持证据。

KUWAYAMA 等[9]设计了一种可测量被分析头发实际生长速度的摄药模型。 为准确估计目标药物的摄入天数，受试者先服用苯海拉明（目标药物），然后以一定的时间间隔服用两次氯苯那敏（时间标记物）。 根据头发中两次时间标记物的浓度高峰所在位置及相应的摄药时间来计算头发的生长速度， 再根据目标药物与时间标记物峰值之间的距离和头发的生长速度来计算目标药物的摄入时间。 通过对甲基麻黄碱、扑尔敏、依匹斯汀、双氢可待因和非索非那丁5 种时间标志物进行比较研究并评估该模型的准确性[8]，认为合适的时间标记物可使摄药时间估计误差减小至2 d 以内，但当时间标记物与目标药物分布类型不同时，摄药时间推断可产生约为10 d 的误差。

本研究团队以药物辅助犯罪案件中经常涉及的艾司唑仑为目标物，构建了两种基于头发MSA技术的摄药时间推断模型[20]。其中：时间标志物推断模型采用志愿者以一定的时间间隔两次摄药后采集头发，按照头发生长速度和毛干目标药物峰值间距离计算摄药时间（图3）；时间间隔推断模型采用志愿者摄药后以一定的时间间隔两次采集头发，根据两次取样时间间隔（ΔT）与两次采集头发样品中形成的目标药物高峰位置移动距离（ΔS）计算个体头发生长速度，然后按照图4 中所示公式计算摄药时间。 本研究团队对所建立的两种推断模型从方法准确度及适用性方面进行比较分析，采用时间标志物推断模型进行时间推断的误差平均为4.3 d，采用时间间隔推断模型进行时间推断的误差平均为7.4 d。笔者认为，该两种摄药时间推断模型的差异在于时间标志物模型所用的是所测头发的实际生长速度，而时间间隔模型估计的头发生长速度并非所测头发的实际生长速度，这可能是该两种时间推断模型误差存在差异的主要原因。

图3 时间标志物推断模型

图4 时间间隔推断模型

头发MSA 也用于估计死亡日期。 某非正常死亡尸体经背景调查死者生前曾有使用利多卡因的医疗记录，使用时间为发现尸体前57 d。 KUWAYAMA等[13]以利多卡因作为自然的内部时间标志物，根据利多卡因的使用时间以及单根毛干中利多卡因的浓度峰值位置估计死亡日期。 研究者认为，与传统的法医病理学尸体检查不同，头发MSA 有可能将死亡时间范围缩小至死亡日期。 本研究团队探索联合使用基于LC-MS/MS 的MSA 技术和基质辅助激光解吸电离质谱成像（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging， MALDI-MSI）技术，以提高摄药时间估计的分辨率。 然而，受MALDI-MSI 分辨率的限制，想要获得更高、更精确的时间分辨率仍较为困难。 此外，头发中毒（药）物可随着头发的生长而扩散和重新分布[23]，由此也影响了摄入时间估计的时间分辨率。 正如POETZSCH等[24]的研究也表明，无论采用何种方法，头发分析的时间分辨率都是数天的范围，而不能精确到确定的某一天。

笔者认为，基于头发MSA 估计摄毒摄药时间仍处于研究阶段，实践中往往会存在一定的误差，尤其应关注以下因素的影响：（1）头发采集应采用拔取方式，全发（毛根和毛干）的长度测量和MSA有利于精准估计摄药时间。 （2）根据头发的生长周期，采集选中静止期和休止期的头发将存在一定的概率，故MSA 必须独立分析至少5 根或更多根头发来保证结果的可重复性。 （3）即使在相同的头部区域收集的头发其生长速度可能也存在差异，对此时间估计模型应尽可能获取所测单根头发的实际生长速度。 此外，用内部时间标记测算，研究团队所得志愿者的头发生长速度约为0.49~0.51 mm/d，KUWAYAMA 等[9]报道研究对象的头发生长速度平均值为（0.45±0.05）mm/d，即约1.4 cm/月。 随着头发分析研究的深化，有必要对头发分析的基本理论假设（1 cm/月）或相关规定作出修正。

2.3 毒（药）物在单根毛发中的分布研究

单根头发MSA 可以较高分辨率描述毒（药）物在单根头发中的分布特征，包括从发根至毒（药）物浓度峰值的距离和毒（药）物阳性区域的峰形，以及在头部不同区域、不同头发间分布的一致性，提供常规束发分段分析不能提供的精细信息。

2.3.1 不同区域头发中毒（药）物的分布研究

外源性毒（药）物在头部不同区域头发中的分布是否存在差异，是否对摄药模式和摄药时间估计的准确性产生影响，是毛发分析领域需要关注的问题。 本研究团队通过对人体头部不同区域（枕部、左颞部、右颞部和顶部）的单根头发进行分析，以考察外源性毒（药）物在不同区域内头发的分布情况以及同一区域内不同单根头发间分布的一致性。 三名志愿者单次摄取唑吡坦28 d 后分别在每一个体头部的四个部位采集5 根头发，结果显示，在枕部和右颞部采集的15 根头发均检出唑吡坦，而左颞部和顶部分别有两根和一根头发呈阴性结果。 对同一部位采集的头发浓度及峰浓度位置的相对标准偏差计算结果显示，枕部采集的头发偏差值较小，其浓度峰值位置以及峰形分布一致性较好。图5 显示某志愿者摄药后唑吡坦在头部四个区域头发中的分布情况。 研究结果表明，枕部头发生长速度变异性较小且处于生长期的头发数量较多，更适合作为头发的采样部位。 尽管国际毛发分析协会已将枕部作为头发分析推荐的采样部位[25]，然而基于束发分析的数据其支撑能力尚有不足，而通过单根头发的微分段分析可以更好地反映外源性毒（药）物在不同部位头发间分布的一致性。

图5 唑吡坦在头部不同区域头发中的分布情况

2.3.2 头发中毒（药）物的进入和保留机制研究

人体摄入毒（药）物后短时间内在单根头发中的浓度-时间分布是揭示毒（药）物进入头发机制的关键[21]。 几乎所有的MSA 研究团队[6，9，20-21，25]在考察单次摄药后目标物在毛干中的分布时都观察到了目标物浓度的双峰现象（图6，S1、S2分别表示浓度高峰和浓度次高峰）。笔者研究团队的XU 等[20]考察了4 名志愿者单剂量摄入艾司唑仑12h、36 h、60 h、13 d、28 d 后目标物在单根毛干上的分布情况。研究发现，摄药后12~60 h 内，在单根头发上呈现两个艾司唑仑浓度峰。其中，高峰位于毛根部的0~0.8 mm，次高峰位于毛根和毛干的交界处（1.6~2.8 mm），两个浓度峰值存在明显的差异。 摄药后13 d，头发中艾司唑仑浓度高峰区带从发根端向发梢端移动，分布于根部9.6~12.8 mm 内，且在根部4 mm 头发段内未检出艾司唑仑，表明药物阳性区带已由毛根移至毛干。 同时，目标物艾司唑仑的浓度双峰现象也被边界不清晰且宽度约为10 mm 的阳性区带所取代。本研究团队的另一项唑吡坦单剂量摄药模型获得了类似的毛干目标物分布结果。

图6 单次摄药后目标物在单根毛发中的分布

本研究团队认为目标物浓度的双峰现象揭示了毒（药）物进入头发的途径。 入体的毒（药）物可通过两种途径进入头发：一是通过血液循环进入毛囊后被毛基质细胞吸收，在头发毛干分布图上表现为近根端的浓度高峰；二是通过汗腺和皮脂腺分泌浸润至真皮区域的毛干，在头发毛干分布图上表现为远根端的浓度小峰。 双峰在毛干中的距离与发根端到头皮的距离一致，而两者的浓度值则反映了这两种途径对于毛干中目标物的贡献度。 然而，KUWAYAMA 等[7]的另一项研究颠覆了血液循环是所有毒（药）物进入毛干主要途径的普遍认知。 该研究者用微分段法研究了同时摄入的7 种药物在单根头发中的分布，观察到7 种药物的浓度-毛干分布特征呈现两种类型，其中依匹斯汀、非索非那定、氯苯那敏、去甲基氯苯那敏和双氢可待因在单根毛干上呈现一大一小的双峰分布，而甲基麻黄碱和麻黄碱在毛干上仅呈现一个主峰，且位于偏远端与真皮层进入途径相匹配的位置。这一发现表明，毒（药）物进入头发的机制和途径可能取决于其结构和性质， 亲脂性化合物主要通过血液循环进入毛根， 而极性化合物则可能主要通过汗腺/皮脂腺途径而非血液途径。 目前，毒（药）物在毛干上的分布特征与其化学性质之间的关系尚未完全阐明，很难确定特定目标物进入头发的主要途径。 未来需要积累更多的毒（药）物的分布特征数据，从而阐明毒（药）物进入头发的一般机制和规律。

KAMATA等[26]为了研究药物进入头发的机制，以甲氧那明为目标物，将志愿者的单根头发毛轴纵向切片，用基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）进行成像，以验证单根头发微分段的LC-MS/MS分布分析结果。 成像结果显示，药物摄入后首先大量集中于毛囊，仅有少量进入头发基质，形成2~3 mm的独特药物带，同时观察到部分药物进入到真皮上部的角质化毛干中，形成另一个约2mm的药物带，两个药物带均随着头发的生长向发梢端移动。 MALDITOF-MS/MS的结果发现与LC-MS/MS分析结果一致。

上述所有研究结果提供了入体的毒（药）物进入头发存在两个途径、两个微区域的直接和直观的证据。 然而这两种途径会导致毛干中目标物的阳性带重叠，从而影响摄药时间判断的分辨率。 在评估头发分析结果时应考虑到这些因素。

2.3.3 头发中毒（药）物的来源判断研究

头发分析结果评判时需要关注的一个重要问题是所检阳性结果系药物摄入还是外部污染?对此通常采用头发的去污染处理和分析目标物的特征代谢物加以鉴别。 然而在某些条件下，目标物的体内代谢产物与体外分解物相同时，如可卡因可以转化为苯甲酰爱康宁、海洛因可能转化为吗啡等，或当使用剂量较低致头发样品中缺乏可测量的代谢物时，往往难以判断目标物的来源。 头发MSA 技术虽然仅能给出毛干纵向目标物的分布而无法给出毛干径向的目标物分布信息，但KUWAYAMA 等[27]认为，根据头发MSA 所得的目标物浓度峰分布特征，可判断头发是否存在阳性目标物的外源性污染。

与MSA 技术不同，MALDI-MSI 技术可给出目标物在单根头发中空间分布的可视化信息，有可能进一步区分阳性目标物系药物摄入还是外部污染。本研究团队研究了采用MALDI-MSI技术判断头发中阳性目标物来源的可行性。 以DFSA案件唑吡坦阳性头发和唑吡坦溶液浸泡的头发为研究对象， 单根头发分别经纵向切割后用优化建立的MALDI-MSI方法进行原位成像分析。 图7显示了唑吡坦阳性头发和唑吡坦浸泡头发样本中唑吡坦（m/z 308.17578，[M+H]+）的MS图像和MS与光学重叠图像，结果表明，唑吡坦阳性头发中目标物分布于毛干内部的髓质和皮质层，而唑吡坦溶液浸泡头发中目标物则主要分布于毛干表皮层，两者存在显著差异，该结果经多根头发验证，一致性良好。通过进一步考察唑吡坦浸泡头发经常规去污清洗后目标物的分布情况， 发现目标药物量虽有所减少但仍存在于毛干两侧。STOUT等[28]曾以小鼠为模型进行结合机制研究，发现荧光素和罗丹明在毛发中的沉积与外部污染明显不同。 与浸泡毛发时观察到的药物与角质层结合相比，体内沉积主要发生在髓质和皮质层。 上述研究表明，MALDIMSI技术可反映毛发中毒（药）物的空间分布，为区分毒（药）物摄入和外部污染，也为探究毒（药）物在毛发中的进入与结合机制提供可视化的支持。

图7 唑吡坦阳性头发和唑吡坦浸泡头发样本中（m/z 308.17578，[M+H]+）MS 图像和MS 与光学重叠图像

2.3.4 毛根中毒（药）物的动力学研究

既往的分布研究多集中于头发的毛干部位，而对于毒（药）物进入毛干的源部位（毛根）则少有触及。 本研究团队曾以豚鼠为实验模型，同步进行毛根与血液的毒物动力学研究，建立毛根、毛干和血液中毒物分布的关联[29-31]。在前期研究基础上，该团队进一步利用MSA 技术考察4 名单次摄药（艾司唑仑1 mg）志愿者单根头发根部5 mm 头发段内艾司唑仑的分布及其动力学模式。 研究结果显示，摄药30 min 后在毛根中检出艾司唑仑，毛根中的艾司唑仑在1.92~4.8h（平均4h，n=24）区间内达到浓度高峰（Tmax）（图8）。艾司唑仑在受试者毛根和血液中的浓度-时间曲线相似，表明外源性物质在毛根中的浓度与血液中的浓度具有关联性。这与普遍认为的外源性物质经过血液循环进入头发的认知相一致。

图8 单次摄药后4 名受试者毛根中艾司唑仑浓度-时间分布曲线（n=6）

本团队研究结果同时显示，摄入艾司唑仑后毛根中药物半衰期平均为3.6 d（n=24）且在毛根中的检测时限可达14 d。GUSTAVSON 等[32]对17 例健康男性受试者进行的艾司唑仑血液药代动力学研究发现，单剂量（1 mg）摄入艾司唑仑后，血液中的艾司唑仑平均半衰期为14 h。 刘岳等[33]对24 名中国健康受试者进行的药代动力学研究发现，单剂量（1 mg）摄入艾司唑仑后血液中艾司唑仑的平均半衰期为21~23 h。 显然，毛根中艾司唑仑的代谢半衰期以及检出时限明显长于血液。 笔者认为，通过不断对毛根蕴含的潜在信息的挖掘，毛根有可能作为血液的补充检材用于提供急性中毒的信息，尤其在血液缺失（如腐败等）或毒物消除（如延缓死亡）的情形下，毛根可提供有价值的即时毒物暴露信息。

KUWAYAMA 等[34]为评估溺水尸体头发中测量药物分布的可能性，使用MSA 技术研究各种水溶液条件下头发样品中药物的稳定性。 结果在不含二价离子（Ca2+和Mg2+）的溶液中，随着盐浓度和浸泡时间的增加，头发中的药物含量减少了约5%；而在含有二价离子的溶液中，药物含量的降低可忽略不计，即二价离子阻止了头发中药物的损失。 由于天然河流和海水中含有二价离子，故其认为利用MSA研究药物分布也可应用于溺死尸体的毛发。

3 头发微样技术的局限性和应用前景

头发MSA 的方法策略和技术发展极大地拓展了毛发分析的证据能力和应用价值。 在理论层面，通过精细表征毒（药）物在毛干中的分布特征，以新的视角探析毛发中毒（药）物的进入和保留机制。 在实践层面，通过精准定位毛干中毒（药）物的浓度高峰位，保障毛发分析对于摄毒时间和摄毒模式判断的可靠性和精准性，从而提升毛发分析的证据地位和应用价值。然而，头发MSA 作为一种新技术，仍存在适用范围受限、方法局限性以及技术改进等问题。

头发微分段的机械化和自动化。 目前无论是采用机器切割法还是手动切割法，头发的毫米或亚毫米的分割以及后续转移至提取管的操作仍是一个复杂、繁琐、费时的过程。KUWAYAMA 等[35]曾尝试用电动微操作器收取0.4mm 头发片段并将其转移到提取管，然而却比手动操作花费了更多的时间。 此外，进一步提高头发分割的空间分辨率仍值得继续探索。尽管头发的纵向更细微的分段价值不大，但径向分割或三维分割有助于研究外源性物质的进入和结合机制，提供外源性物质是通过血循环或是通过汗液和皮脂腺渗透进入毛发基质之间差异的更详细信息。

谨慎解释MSA 分析结果。由于每根头发基质细胞的活性不同、所处生长阶段不同，故无论不同个体还是同一个体同一头部区域的单根头发间的毒药物分布特征都可能存在一定的差异。 若两根头发间毒药物的分布模式显著不同，则可能该两根头发处于生长周期的不同阶段，故MSA 法必须通过独立分析两根或两根以上的头发获得相似的分布结果才能进行确认。由于两根头发分析结果的匹配概率较低，大部分研究者认同MSA 法应收集5 根头发。 其次，要评估单根头发毒药物分布特征可能受到头发长期暴露以及洗涤、阳光、染发、烫发等自然和非自然因素的影响，谨慎解释长发发梢端毒物分布、峰值浓度下降以及可能出现的假阴性。再者，不同种族的头发颜色和粗细存在显著差异，而头发中的黑色素对毒药物的进入和结合有很大影响。MIYAGUCHI 等[36]研究了日本人群黑色头发和白色头发中唑吡坦浓度的差异，结果日本人群黑发与中国人群黑发的唑吡坦浓度相似，远高于白色头发中的浓度。

MSA 方法的局限性。 值得注意的是，目前所有MSA 法研究的对象仅限于黑色头发人群，其在白色头发人群的适用性、可行性尚需要评估。 同理由于MSA 法的头发样本微量，需要关注难以进入和结合于毛发基质的中性、酸性药物的可检出性。 此外，目前研究结果表明，在摄药时间估计方面采用内部时间标志物的精度更高，但在实践中涉案者再次摄药的可操作性存在一定难度。

如同所有的技术方法，MSA技术存在其特有的优势和局限。 但笔者认为随着MSA和MALDI-MS技术平台的发展，联合使用两者可能会更好地解决摄毒模式和摄毒时间判断，以及阐明毒药物进入机制的难题。